7. Tecnologie della riproduzione assistita (preparazione ovociti: coh, ohss aspirazione transvaginale + preparazione spermatozoi: swim up, macs, pesa, mesa, tesa, tese)+ iui, fivet, icsi+ trasferimento embrione

Tecnologie della riproduzione assistita (ART)

Preparazione degli ovociti

Nei trattamenti di procreazione medicalmente assistita (PMA) sono necessari entrambi i gameti: lo sperma, che viene fornito mezz’ora prima della fecondazione, e gli ovociti, che vengono forniti dal ginecologo che ha effettuato l’aspirazione follicolare. Le donne che intendono intraprendere un percorso di fecondazione assistita saranno sottoposte a sovraovulazione (meglio conosciuta come iper-stimolazione ovarica controllata COH), processo secondo il quale si ha la produzione di più ovociti maturi anziché di uno solo.

Un reclutamento follicolare multiplo è ottenibile mediante l’utilizzo di farmaci in grado di ampliare il tempo di rilascio dell’FSH, determinando quindi una sorta di salvataggio di quei follicoli che erano destinati all’atresia durante il ciclo. A tal fine, i farmaci più comunemente utilizzati sono:

• Gonadotropine umane, naturali o prodotte con tecniche ricombinanti. Le gonadotropine agiscono direttamente stimolando i follicoli ovarici e possono essere somministrate per via intramuscolare o per via sottocutanea. Tra i preparati attualmente utilizzati nell’induzione multipla dell’ovulazione si distinguono: gonadotropina menopausale umana altamente purificata (hMG-HP), purificata dalle urine di donne in menopausa; FSH umano urinario altamente purificato (u-hFSH-HP), purificato con cromatografia per affinità a partire dall’urina umana; FSH ricombinante (rFSH) + LH ricombinante (rLH), ottenuti ciascuno con tecnologie del DNA ricombinante mediante transfezione dei geni dell’FSH e LH umani in cellule animali e successiva purificazione del surnatante.
• Analoghi del GnRH: questi hanno elevata affinità per il recettore ipofisario. La somministrazione cronica di GnRH-a determina in una prima fase una massiva dismissione di gonadotropine (effetto flare up) con una successiva inibizione della sintesi e del rilascio. In questo modo verrà a mancare l’FSH, che fisiologicamente induce la maturazione follicolare, ma verrà a mancare anche l’LH che, invece, induce all’ovulazione e inibisce l’ulteriore maturazione follicolare quando uno di essi è già maturato ed è pronto per l’ovulazione. L’effetto flare up si prolunga per alcuni giorni oltre la sospensione della somministrazione dei GnRH-a. Dopo la somministrazione di GnRH-a, si deve procedere con la stimolazione della maturazione follicolare mediante la somministrazione di gonadotropine. Oppure si può procedere con una somministrazione contemporanea di GnRH-a e gonadotropine in fase follicolare, seguita da una somministrazione di hCG, che induce una repentina ovulazione.
• Clomifene citrato, che lega i recettori degli estrogeni. Questi ultimi, raggiunta una concentrazione limite verso la fine della fase follicolare, inibirebbero con un feedback negativo l’ulteriore rilascio di FSH, bloccando la maturazione di ulteriori follicoli. Se i recettori degli estrogeni vengono occupati dal clomifene citrato, gli estrogeni non potranno più svolgere la loro azione. Pertanto verrà rilasciato altro FSH, prolungando di conseguenza la fase follicolare, e quindi la maturazione di altri follicoli.
• Inibitori delle aromatasi, che, come il clomifene citrato, agiscono sugli estrogeni. Se il clomifene citrato, però, blocca i recettori degli estrogeni e la produzione di estrogeni, quindi, avviene lo stesso, gli inibitori delle aromatasi bloccano il processo secondo cui dagli androgeni si formano gli estrogeni.

Una stimolazione ovarica eccessiva induce alla cosiddetta sindrome da iper-stimolazione ovarica (OHSS). Tale patologia si verifica quando all'interno delle ovaie un numero elevato di follicoli (15-20 o più) raggiunge lo stadio di follicolo maturo. La sindrome da iperstimolazione ovarica si manifesta con abnorme sensazione di gonfiore addominale, aumento di peso (da ritenzione di liquidi), senso di pesantezza al bacino, diminuzione della quantità di urina giornaliera (oliguria) aumentata sensazione di sete.

Dopo aver sottoposto la donna a trattamenti ormonali si può procedere con il prelievo degli ovociti. Il prelievo degli ovociti viene eseguito il più delle volte tramite aspirazione trans-vaginale, cioè viene introdotta una sonda ecografica attraverso la vagina, alla quale sonda è collegato un supporto per l’ago che serve ad aspirare il liquido dell’antro follicolare, dove nuota l’ovocita. È bene ricordare che l’ovocita inizia a nuotare nell’antro solo 36 ore prima dell’ovulazione ed è quindi in questo arco di tempo che si dovrebbe effettuare il prelievo. Quindi, attraverso la sonda ecografica si può monitorare l’operazione su uno schermo e con l’ago si aspira il liquido follicolare. L’ago è collegato ad una provetta, quindi il liquido follicolare è direttamente versato in questa provetta. Sarà immediatamente effettuata una osservazione al microscopio per vedere se l’ovocita è presente e se è in un giusto stadio di maturazione, considerando, quindi, le caratteristiche morfologiche dell’ovocita. Prima dell’aspirazione la donna viene trattata con anestesia locale.

Il recupero degli ovociti attraverso aspirazione trans-vaginale diventa particolarmente difficile quando, ad esempio, la donna è obesa. In questi casi la donna potrebbe essere considerata non idonea oppure si può eseguire un prelievo degli ovociti in laparoscopia. In generale, la laparoscopia prevede l’inserimento di strumenti chirurgici in miniatura, tra cui una piccolissima sonda dotata di telecamera a fibre ottiche e di una piccolissima fonte di illuminazione, senza dover ricorrere a dei grossi tagli. Quindi è una tecnica poco invasiva. Nel caso di una biopsia, come nel prelievo degli ovociti, oltre alla telecamera serve anche l’ago per l’aspirazione dell’ovocita. In generale, differentemente dall’aspirazione trans-vaginale, questa tecnica prevede l’anestesia totale della paziente. Inoltre, il prelievo degli ovociti in laparoscopia prevede l’iniezione di CO₂ nella cavità peritoneale per causare un temporaneo pneumoperitoneo, cioè aumento del volume della cavità peritoneale. La presenza di CO₂ potrebbe essere dannosa per l’ovocita. Prima del prelievo dell’ovocita in laparoscopia è bene eseguire diverse scansioni trasversali e longitudinali della pelvi, al fine di localizzare esattamente le ovaie e di posizionare la sonda in modo tale che tra essa e il follicolo da raggiungere vi sia la minore quantità possibile, teoricamente 1 cm o meno, di tessuto.

Negli ultimi anni, per il prelievo degli ovociti, sia esso effettuato tramite aspirazione vaginale o sia esso effettuato tramite laparoscopia, si impiegano dei particolari aghi dotati di un doppio lume. Immaginiamo questi aghi come due tubicini, uno esterno con diametro maggiore e uno interno con diametro minore e immaginiamo che tra i due tubicini ci sia uno spazio. Gli aghi a doppio lume sono stati sviluppati per superare la potenziale ritenzione di ovociti. Cioè, potrebbe succedere che nel momento in cui si procede all’aspirazione dell’ovocita, questo ancora non abbia iniziato la fase di rottura della vescicola germinale, cioè potrebbe succedere che l’ovocita, nonostante avesse raggiunto la maturazione, ancora non si stacchi dalla parete follicolare. Quindi un lume dell’ago serve per inserire un terreno di coltura liquido che favorisce il distacco dell’ovocita, mentre l’altro lume serve ad aspirare il liquido follicolare (mescolato, quindi, al terreno) che dovrebbe contenere l’ovocita staccatosi grazie alla stimolazione artificiale.

Se gli aspirati follicolari (indipendentemente dal metodo) non possono essere esaminati immediatamente, devono essere raccolti in provette sigillate ermeticamente e mantenute rigorosamente a 37°C fino a quando non raggiungono il laboratorio. L’aspirato follicolare viene diluito in un tampone addizionato di eparina per evitare la formazione di coaguli. L’aspirato follicolare contiene, oltre al liquido follicolare e all’ovocita, anche cellule della granulosa e sangue. Giunto in laboratorio, l’aspirato follicolare verrà diviso in due o tre piastre Petri, formando uno strato sottile di fluido che può essere rapidamente, accuratamente e facilmente scansionato per la presenza di un ovocita. Una volta trovati gli ovociti, questi vengono lavati in un mezzo tamponato e osservati al microscopio allo scopo di valutarne la loro maturazione. Dopodiché vengono posti in coltura in un terreno addizionato con albumina umana. L’ovocita risultato idoneo tra quelli prelevati potrà essere denudato o mantenuto nel complesso cumulo ooforo in base alla tecnica di inseminazione scelta (vedi dopo).

Preparazione degli spermatozoi

Poco dopo il prelievo degli ovociti, al partner maschile viene chiesto di produrre tramite masturbazione un campione seminale che, dopo adeguata preparazione, viene utilizzato per inseminare gli ovociti. Per quanto riguarda la raccolta dello sperma bisogna attenersi a delle norme, quali:

• Astinenza per 4 fino a 6 giorni.
• Raccogliere l’intero campione nel contenitore sterile; il 70% degli spermatozoi si trova nella prima parte dell’eiaculato.
• Mantenere il campione a temperatura corporea, lontano dalla luce solare.
• Prelevare il campione entro un’ora dall’eiaculazione.

Il presupposto irrinunciabile per poter effettuare una delle tante tecniche di riproduzione assistita è rappresentato dall’impossibilità di utilizzare il liquido seminale in toto. Lo sperma (o liquido seminale) è un liquido viscoso composto da una miscela di secrezioni testicolari ed epididimali, secrezioni prostatiche, prodotte al momento della eiaculazione, che nell’insieme prendono il nome di plasma seminale e spermatozoi. Il liquido seminale contiene, inoltre, delle sostanze che inibiscono la fecondazione. Per questo, un punto chiave della preparazione dello sperma è l’allontanamento degli spermatozoi dal liquido seminale, eliminando così prostaglandine, lipochine, citochine e possibili agenti infettivi, oltre a ridurre al minimo la presenza di radicali liberi. Oltre alla separazione fisica, è importante concentrare gli spermatozoi in un piccolo terreno di coltura e isolare quelli più sani e che si muovono con più agilità, utilizzando una tecnica che sia il più rapida, economica ed efficace possibile.

Fisiologicamente, la selezione degli spermatozoi avviene a livello del collo (o cervice) dell’utero, dove è presente il muco cervicale. Gli estrogeni, il cui picco si verifica in prossimità dell’ovulazione, stimolano le cellule cervicali a secernere un muco vischioso, trasparente e acellulare. Questo muco risulta alcalino allo scopo di neutralizzare la tipica acidità del canale vaginale e aumentare, di conseguenza, la sopravvivenza degli spermatozoi. Nei primi giorni dopo la mestruazione il muco cervicale è scarso, spesso addirittura assente. Con l’inizio dei giorni fertili e l’approssimarsi dell’ovulazione il muco cervicale aumenta in concentrazione, è umido, scivoloso e in grado di formare lunghi filamenti se esteso tra pollice e indice. Durante questo periodo, il muco appare come una rete, le cui maglie permettono il passaggio degli spermatozoi anche se non di tutti.

Con il superamento dell’ovulazione il muco tornerà infine più spesso e appiccicoso. Nell’utero gli spermatozoi subiscono un forte attacco da parte del sistema immunitario della donna: i leucociti lavorano per evitare l’entrata di organismi/cellule estranee nel corpo della donna e fagocitano gli spermatozoi che riescono a intrappolare. Solo chi riesce a passare indenne questa barriera immunitaria può passare nelle tube. Le tube sono piccolissime da trovare. Sembra però che gli spermatozoi siano favoriti nel trovare quella giusta.