7 PCR e progettazione primer e primer degenerati

Primer e PCR

I primer, in natura all'interno delle cellule, sono degli inneschi utilizzati durante la replicazione del DNA. Sono dei corti frammenti di RNA e non di DNA, differentemente da quanto ci si aspetterebbe, perché l’enzima DNA polimerasi, che è quello che catalizza la sintesi del nuovo filamento, non è in grado di creare ex-novo un filamento ma solo di allungare l’estremità libera 5’-OH. Quindi, in assenza di un innesco come il primer non avrebbe inizio la replicazione del DNA. L’RNA polimerasi, differentemente dalla DNA polimerasi, è in grado di sintetizzare ex novo un filamento di RNA ed a questo è dovuta l’importanza e l’utilità del primer.

Uso dei primer sintetici in biologia molecolare

I primer sono utilizzati in molte tecniche di biologia molecolare che richiedono la DNA-polimerasi, come in alcune tecniche di sequenziamento del DNA e nella reazione a catena della polimerasi (PCR). I primer usati in queste tecniche sono dei corti frammenti di DNA (differentemente da quanto accade in natura), della lunghezza di 18-20 basi. Questi inneschi sono costruiti in laboratorio attraverso una sintesi chimica.

PCR

La PCR è una tecnica che consente di ottenere rapidamente milioni di molecole identiche di DNA a partire da quantità estremamente ridotte dell’acido nucleico. Infatti, la PCR è una reazione di amplificazione in vitro di uno specifico frammento di DNA per mezzo di una DNA polimerasi. Nella reazione sono coinvolti due oligonucleotidi a singolo filamento (primer) complementari, uno all’estremità 3’ e l’altro all’estremità 5’ del segmento di DNA che si vuole amplificare, che costituiscono gli elementi di innesco dell’attività della DNA polimerasi. Altri elementi coinvolti nella reazione sono i desossiribonucleotidi (unità del DNA, ciascuna composta da una base azotata, uno zucchero desossiribosio e uno o più gruppi fosfato) e il MgCl₂: i primi sono necessari per la sintesi delle nuove eliche ed il secondo rappresenta il cofattore indispensabile alla DNA polimerasi e maggiore è la quantità di MgCl₂, minore sarà la specificità di legame tra primer e filamento bersaglio, cioè i primer legheranno anche le estremità che non sono perfettamente complementari.

Inizialmente veniva utilizzata una DNA polimerasi prodotta da E. Coli. Tuttavia, questo enzima non è stabile alle alte temperature e viene inattivato durante la fase di denaturazione di ciascun ciclo PCR. Era pertanto necessario aggiungerne una nuova aliquota prima della fase di estensione, che veniva effettuata ad una temperatura di 37 °C. Tutto ciò rendeva la tecnica laboriosa e costosa e aumentava la probabilità di avere prodotti di reazione aspecifici. Nel 1988 fu isolata una DNA polimerasi termostabile prodotta dal batterio termoresistente Thermus aquaticus (Taq DNA Polimerasi). L’uso di questa polimerasi ha consentito di effettuare la fase di estensione a 72 °C aumentando la resa e la specificità dei prodotti di reazione e soprattutto ha reso possibile l’automazione del processo.

Fasi della PCR

La reazione prevede il succedersi di cicli di amplificazione durante i quali si alternano tre diverse temperature che rendono possibile rispettivamente:

• La denaturazione della doppia elica del DNA stampo in due singole eliche (alla temperatura di 95 °C). Normalmente, il DNA si trova nella classica conformazione a doppio filamento in cui i due filamenti (strands) del DNA sono tenuti assieme dai legami a ponte di idrogeno formati tra le basi azotate complementari (A:T; G:C). Il DNA deve essere portato ad una condizione di singola elica (single-stranded) in modo che successivamente si verifichi l’appaiamento (annealing) alle molecole di primer (anch'esse a singolo filamento). Per fare ciò, la soluzione contenente il DNA viene portata ad una temperatura al di sopra della sua “temperatura di fusione (Tm)”, nella quale i legami ad idrogeno, non più stabili, permettono la separazione tra i due singoli filamenti del DNA. La Taq DNA polimerasi ha solitamente una emivita di 30 min a 95 °C.
• L’appaiamento degli inneschi oligonucleotidici (annealing) alle sequenze di DNA a singola elica ad essi complementari e localizzati alle estremità del frammento bersaglio (ad una temperatura in genere compresa tra i 50 ed i 70 °C). La temperatura che favorisce l’unione tra primer e DNA è detta Temperatura di annealing (Ta). La temperatura di annealing (Ta) dei primer dipende dal loro contenuto in G+C e dalla loro lunghezza. Considerando primer di lunghezza media di 20 basi, una formula empirica spesso utilizzata per il calcolo della Tm è la seguente: Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] °C.
• Dove G, C, A e T indicano il numero di nucleotidi contenenti le basi azotate guanina, citosina, adenina o timina. Nel caso che i due primer abbiano Tm diverse, generalmente si considera quello con la Tm più bassa. Solitamente si utilizza come temperatura di annealing: Ta = Tm – 5 °C.