7 b.Anticorpi monoclonali: generalita' struttura anticorpi; tecnica dell'ibridoma; isolamento ibridoma; a. Monoclonali chimerici e umanizzati; ; a. Monoclonali umani; tecniche di produzione a. Monoclonali

Anticorpi monoclonali

Una classe di proteine che è stata utilizzata a scopo terapeutico è costituita dagli anticorpi monoclonali. Con questo termine si fa riferimento ad anticorpi prodotti artificialmente in grandi quantità e sono diretti specificamente contro un determinato antigene che viene prodotto, ad esempio, da una malattia infiammatoria oppure possono essere diretti contro un antigene che si presenta su specifiche cellule tumorali causando la loro neutralizzazione. Questi anticorpi possono essere somministrati da soli oppure possono essere coniugati con una sostanza radioattiva che eroga l’irradiazione direttamente sulle cellule tumorali.

Gli anticorpi

Ciascun individuo possiede un enorme repertorio di anticorpi differenti che fungono da sistema di difesa contro gli innumerevoli antigeni esterni. Se un corpo estraneo, quale un patogeno, riesce a superare i meccanismi di difesa dell’immunità innata viene chiamata in causa l’immunità adattativa (o acquisita). Nell’ambito di questo sistema possiamo distinguere due tipi di risposte: una risposta detta cellulo-mediata (o cellulare) e una risposta detta umorale. Nella risposta cellulare intervengono il linfociti T; nella risposta umorale, invece, intervengono i linfociti B.

Nel caso dei linfociti B, questi riconoscono l’antigene grazie al legame tra questi e le immunoglobuline (Ig o anticorpi) che vengono prodotti dai linfociti B stessi. Gli anticorpi sono sempre costituiti da quattro catene polipeptidiche. Due di queste catene, uguali nella loro sequenza amminoacidica, sono chiamate catene leggere o catene L; le restanti due, anch’esse uguali nella sequenza, sono chiamate catene pesanti o catene H. Le quattro catene si combinano tra di loro a formare una struttura ad Y. In questo tipo di organizzazione strutturale, ogni catena pesante è legata a una leggera e le due pesanti sono legate tra di loro. Le catene pesanti si associano tra loro e alle catene leggere per mezzo di ponti di solfuro e di interazioni non covalenti. Questa struttura di base dell’anticorpo viene definita monomero.

Bisogna precisare che lo stelo della struttura ad Y di un anticorpo prende il nome di frammento FC (Frammento Cristallizzabile); il dominio di legame all’antigene è, invece, detto frammento Fab. Il frammento cristallizzabile è in grado di formare complessi con altre strutture se immerso in un liquido proteico; la sua funzione è quella di interagire con numerosi recettori chiamati Fcr, posti sulla superficie di molte cellule immunitarie (macrofagi, neutrofili, eosinofili, basofili, linfociti B).

In ogni catena, pesante e leggera, è possibile distinguere una regione variabile (dove la sequenza amminoacidica è soggetta a variazioni e sono N-terminali) da una regione costante (dove la sequenza amminoacidica subisce limitate variazioni). Nel caso delle catene leggere, la regione costante è unica ed è indicata con la sigla C_L; mentre, le catene pesanti hanno tre regioni costanti (C_H1, C_H2, C_H3).

Inoltre, all’interno delle regioni variabili, sia delle catene leggere che delle catene pesanti, sono presenti sequenze che hanno un più elevato tasso di variabilità, dette regioni ipervariabili (o CDR) e sono le regioni direttamente coinvolte nel legame con l’antigene. È bene sottolineare che un anticorpo riconosce una porzione dell’antigene che prende il nome di epitopo.

Un individuo produce tante tipologie di anticorpi e ciascuna tipologia è prodotta da una determinata linea di linfociti B. Questo venne inizialmente giustificato con la teoria germinale, secondo la quale ad ogni tipologia di anticorpo corrisponde un gene, ma questa teoria implicava che il nostro genoma doveva essere costituito da soli geni per gli anticorpi. Successivamente, con l’avvento delle nuove tecniche, prese piede la teoria della diversificazione somatica, secondo la quale esiste una notevole ma non infinita variabilità genetica nell’ambito dei geni che codificano per gli anticorpi e a questa si sovrappone una spiccata mutabilità somatica dei geni che codificano per gli anticorpi.

Oggi sappiamo che le regioni geniche che codificano per le catene pesanti e leggere degli anticorpi presentano un’organizzazione strutturale unica e peculiare e che, durante la maturazione dei linfociti B, vanno incontro ad estesi riarrangiamenti, promuovendo la formazione di nuove combinazioni di sequenze nucleotidiche. Partiamo dall’analisi dei geni che codificano per le immunoglobuline. Per meglio comprendere tale struttura genica, riosserviamo la struttura delle immunoglobuline. Come detto, ogni anticorpo presenta due catene leggere e due catene pesanti. Ogni catena pesante è formata da una regione costante e una regione variabile, che a sua volta comprende un segmento V, un segmento D e un segmento J. La porzione variabile della catena leggera è, invece, formata dal solo segmento V e dal segmento J.

Struttura dei geni degli anticorpi

Quindi ora si può spiegare la struttura dei geni che codificano per gli anticorpi. Innanzitutto possiamo dire che i geni sono raggruppati in tre loci: locus H che contiene i geni che codificano per la catena pesante ed è localizzato sul cromosoma 14; locus K che contiene i geni che codificano per la catena leggera ed è localizzato sul cromosoma 2; locus lambda che anch’esso contiene i geni che codificano per la catena leggera, ma è localizzato sul cromosoma 22. Il locus H, prima della maturazione linfocitaria, presenta 40 variabili del gene V, 25 del gene D, 6 del gene J e poi presenta i geni per i segmenti C_H1, C_H2, C_H3.

Nei locus lambda e K non esistono i segmenti genici D, ma esistono solo i segmenti V, J e C. Nel locus k ci sono 40 variabili del gene V e 5 del gene J; nel locus lambda ci sono 30 variabili del gene V e 4 del gene J. Bisogna precisare che non tutti i segmenti genici di un unico locus vengono codificati per formare i vari segmenti della catena pesante e leggera di un’unica immunoglobulina. Si verificano, infatti, dei riarrangiamenti, secondo i quali, in parole molto semplici, viene presa una variante del gene V, una variante del gene D e una del gene J a formare un unico gene. Questo riarrangiamento ovviamente è riferito al locus H, ma il discorso è analogo per gli altri locus.

Questi riarrangiamenti possono avvenire in diversi modi; uno tra questi meccanismi è la ricombinazione somatica, catalizzata dall’enzima ricombinasi RAG. Consideriamo il locus H, ad esempio. L’enzima taglia il DNA tra due varianti D e due varianti J; i frammenti esterni che si formano vengono tra loro uniti e si forma un segmento derivante dalla fusione di una variante D con una variante J. Il segmento così formatosi è detto DJ. Poi vengono effettuati altri due tagli: uno tra due varianti V e uno in prossimità del segmento DJ in modo che questo rappresenti l’estremità di un filamento. Si ha, poi, la fusione di DJ con la variante V a formare il segmento VDJ. Questo viene trascritto, insieme ai tre geni per la porzione costante della catena pesante, a formare un pre-mRNA. Questo subisce, poi, un processo di maturazione a mRNA privo di introni. Quest’ultimo viene tradotto a formare la porzione variabile della catena pesante e la sua porzione costante.

Discorso analogo viene fatto per la ricombinazione somatica per il locus K e i locus lambda. In questo caso, però, manca il segmento D, quindi si formerà solo il segmento VJ. Inoltre, dato che le catene leggere possono essere codificate sia dal locus H che dal locus lambda, succede che il locus K (di solito il primo interessato agli eventi di rimescolamento), dopo aver codificato per la catena leggera, impedisce che lo stesso venga fatto dal locus lambda (esclusione allelica). A contribuire a questa variabilità è anche il fatto che quando i segmenti V, D e J vengono uniti, nel punto di giunzione possono essere aggiunte o delete alcune basi ad opera dell’enzima deossinucleotidil-transferasi terminale (TdT). Si parla in questo caso di diversità giunzionale. Inoltre, la diversità delle immunoglobuline è favorita da fenomeni di ipermutazione somatica, cioè mutazioni puntiformi interessano in modo casuale i segmenti V, D e J. Queste mutazioni possono aumentare o diminuire l’affinità degli anticorpi per gli antigeni. Quindi vengono selezionati positivamente solo quei segmenti genici caratterizzati da mutazioni puntiformi che aumentano l’affinità dell’immunoglobulina, che viene codificata da quel determinato segmento, agli antigeni.

Percorso dei linfociti B

Tutti questi eventi di riarrangiamento del DNA accompagnano il percorso maturativo e differenziativo del linfocita B, che ha inizio nel midollo osseo e si conclude negli organi linfoidi periferici. Nei linfociti B naive (vergini), ovvero quei linfociti che non hanno ancora incontrato nessun antigene, le prime immunoglobuline che compaiono sono le IgM e le IgD. A questo stadio, il linfocita B migra dal midollo osseo al circolo ematico e linfatico per raggiungere i diversi distretti dell’organismo e gli organi linfoidi periferici (milza e linfonodi). In seguito all’incontro con un antigene (riconosciuto dalle IgD che sono anticorpi di membrana), il linfocita B inizia un processo di attivazione.

L’attivazione del linfocita B promuove un ultimo ma molto importante fenomeno che va sotto il nome di switching isotopico che consente al linfocita di scegliere se continuare a produrre IgM e IgD o promuovere la sintesi e il rilascio di IgG, IgA e IgE. In pratica, il primo contatto che avviene tra un linfocita B maturo e l'antigene è seguito nelle successive 48-72 ore da uno stadio di raccolta delle informazioni necessarie alla sintesi dell'adeguato anticorpo (periodo induttivo). Una volta terminato questo lasso di tempo, il linfocita B maturo si divide per mitosi, producendo una plasmacellula ed una cellula della memoria.

I linfociti che producono gli anticorpi e che, quindi, subiscono questo processo di attivazione prendono il nome di plasmacellule. La plasmacellula secerne una grande quantità di anticorpi, ma muore dopo circa 7 giorni. La cellula della memoria invece ha la capacità di sopravvivere anche per tutta la vita dell'organismo. Queste cellule continuano a vagare nell'organismo in cerca dell'antigene. Nel caso tali cellule scovino un antigene specifico una seconda volta, la risposta immunitaria (definita ora secondaria) è estremamente più rapida: inizia subito infatti la produzione dell'adeguato anticorpo.

Classi di anticorpi

Gli anticorpi possono essere raggruppati in cinque classi: IgM, IgG, IgD, IgE, IgA. Le IgD, IgE e le IgG svolgono le loro funzioni in forma di monomeri; diversamente, le IgA e le IgM svolgono le loro funzioni rispettivamente in forma di dimero e di pentamero. IgG sono la classe di anticorpi più abbondante nel sangue e nei fluidi extravascolari e compaiono quando l’organismo viene esposto per la seconda volta ad uno stesso antigene. Sono gli unici anticorpi (in particolare IgG1 e IgG3) in grado di oltrepassare la placenta e, pertanto, rappresentano il sistema di difesa iniziale dei neonati.