7 b.Anticorpi monoclonali: generalita' struttura anticorpi; tecnica dell'ibridoma; isolamento ibridoma; a. Monoclonali chimerici e umanizzati; ; a. Monoclonali umani; tecniche di produzione a. Monoclonali

Struttura terziaria della regione

Con lo sviluppo di nuove tecniche di ingegneria anticorpale è stato possibile creare degli anticorpi monoclonali che di murino hanno solo le regioni CDR. Questo nuovo approccio che permette la produzione di questi anticorpi è chiamato CDR-grafting.

Per produrre anticorpi umanizzati bisogna innanzitutto estrarre l'mRNA che codifica per l'anticorpo di interesse dagli ibridomi selezionati con il metodo ELISA. Questi mRNA vengono retro-trascritti per formare cDNA. Si ottengono così i geni che codificano per le catene pesanti e leggere dell'anticorpo di interesse. Questi geni vengono clonati, amplificati tramite PCR e sequenziati per selezionare le sequenze che codificano per le porzioni variabili per le catene leggere e pesanti. I geni per le porzioni variabili presentano un'alternanza di sequenze che codificano per le regioni FR delle regioni variabili e sequenze che

Codificano per le regioni CDR delle regioni variabili. Successivamente si progettano coppie di primer per ciascuna sequenza che codifica per la corrispondente regione CDR. Essendo sei regioni CDR (tre per la catena pesante e tre per la catena leggera), vengono progettate 6 coppie di primer. Ogni coppia di primer porta una coda di 12 nucleotidi complementare a una porzione della sequenza che codifica per le regioni framework umane. Una volta amplificato ogni CDR, ciascuno di essi con 6 cicli di mutagenesi mirata viene sostituito ai CDR umani nei geni che codificano per le regioni variabili degli anticorpi umani.

MUTAGENESI PER LA SOSTITUZIONE DEI CDR 5’-------------------------------------------------------------------------------------------3’3’--------------------------------------------------------------------------------------------5’

CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 FR1 3’3’5’---------------FR1 umano CDR1

murino------------------------------------------------------------5’CDR1 murino FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

Geni umani

Geni umani

CDR1 murino FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

3’ ----------------------------------------------------------------3’

FR1 umano CDR2 CDR3 FR4

FR2 FR3

FR1 umano CDR1 murino Geni umani

Questi geni ricombinanti e codificanti per le regioni variabili delle catene leggere e pesanti, insieme ai geni codificanti per le regioni costanti delle catene leggere e pesanti, vengono clonati in vettori e trasferiti in cellule come quelle di E.coli. Questi geni, quindi, codificano per anticorpi umani ma che contengono le CDR murine specifiche per l’antigene di interesse.

Dal nome dell’anticorpo posso capire se è un anticorpo chimerico, umanizzato o umano. Quelli chimerici hanno la “xi” (infliximab), umanizzati

ANTICORPI MONOCLONALI UMANI

Nel corso degli anni sono state sviluppate altre tecniche, le quali hanno permesso di produrre anticorpi umani mirati contro un antigene di interesse in organismi murini. In questo caso vengono creati dei topi nelle cui cellule sono presenti geni che codificano per le immunoglobuline umane e una parte dei topi così prodotti, quando immunizzati con un antigene di interesse, producono anticorpi esclusivamente umani mirati contro quell'antigene. Per produrre questi tipi di topi bisogna innanzitutto silenziare i geni che codificano per le immunoglobuline murine. Quindi si effettua un Knock-down genico: in questo caso, si utilizzano oligonucleotidi mirati contro il gene al fine di bloccare la sua traduzione. Ovviamente questa operazione viene effettuata a livello embrionale in modo da ottenere topi che sono privi di un sistema immunitario. In un embrione di un altro topo si

Inseriscono i geni per le immunglobuline umane clonati in cromosomi artificiali di lievito. Da questo embrione si sviluppa un topo dotato sia di anticorpi umani che murini. Accoppiando la prima di tipologia di topo con il secondo, si ha il 25% di probabilità di ottenere uno xenomouse, ovvero un topo con geni umani per le catene pesanti e leggere dell'anticorpo attivi e che, quindi, è capace di produrre immunoglobuline umane. Con la tecnica dell'ibridoma si possono così ottenere ibridomi in grado di produrre anticorpi totalmente umani per uno specifico antigene.

ALTRE TECNICHE PER OTTENERE ANTICORPI MONOCLONALI UMANI

PRODUZIONE DI ANTICORPI IN CELLULE DI E. COLI

Un metodo alternativo meno costoso e più breve per ottenere gli anticorpi monoclonali umani mirati contro un antigene di interesse prevede di produrli in cellule di E. coli. In questo caso bisogna estrarre l'mRNA da linfociti B isolati di uomo; convertire l'mRNA in cDNA; si amplificano i

pesante viene clonato nel vettore batteriofagico M13, mentre il cDNA relativo alla catena leggera viene clonato in un altro vettore batteriofagico. I due vettori vengono poi combinati insieme per la produzione di anticorpi monoclonali. Il phage display è una tecnica utilizzata per la produzione di anticorpi monoclonali umani. In questo caso, si utilizza il fago filamentoso M13, un virus che è in grado di produrre porzioni anticorporali che vengono esposte sulla sua superficie. Solo i fagi che espongono queste porzioni possono essere identificati e il loro DNA viene isolato e trasferito in E.coli, dove avviene la replicazione e la traduzione dei geni, compresi quelli che codificano per le porzioni anticorporali. Per questa tecnica, vengono estratti gli mRNA che codificano per le regioni variabili delle catene pesanti e leggere degli anticorpi. Da questi mRNA viene ricavato il cDNA, che viene amplificato tramite PCR. Il cDNA relativo alla catena pesante viene clonato nel vettore batteriofagico M13, mentre il cDNA relativo alla catena leggera viene clonato in un altro vettore batteriofagico. I due vettori vengono poi combinati insieme per la produzione di anticorpi monoclonali.

leggera viene unito, per mezzo di un linker, al cDNA della catena pesante. Questo costrutto viene, poi, inserito nel vettore M13 batteriofagico in prossimità del gene che codifica per la proteina P3 del batteriofago M13: così facendo, quando questo vettore esprime le sue proteine P3 (proteine di membrana utilizzate per il legame con il pilo batterico), queste proteine risultano legate alle regioni variabili delle catene pesanti e leggere. Con questo procedimento, alcuni batteriofagi M13 non presentano sulla loro superficie queste porzioni anticorporali: per identificare quali di questi virus portano sulla loro superficie le regioni variabili degli anticorpi si utilizza un sistema di micro-pozzetti all’interno dei quali è presente un antigene in grado di legarsi all’anticorpo di interesse. Per identificare il pozzetto che contiene il batteriofago legato all’antigene per mezzo di anticorpi esposti sulla superficie di questi virus si può procedere

aggiungendo un anticorpo coniugato con un enzima e poi aggiungendo un substrato per quell'enzima. Identificato il o i pozzetti contenenti il batteriofago che esprime l'anticorpo di interesse, si isolano questi virus, si estrae il loro DNA che viene subclonato in vettori di espressione e inseriti in organismi come E. coli in modo da poter ottenere questi piccoli complessi molecolari, che hanno una specificità alta per riconoscere determinati antigeni. PHAGE DISPLAY CON CELLULE DI E.COLI In alcuni casi viene applicata una specie di phage display anche in relazione a cellule di E.coli. Queste cellule vengono trasformate con vettori contenenti il gene che codifica per gli anticorpi di interesse. Questo gene viene fuso con una sequenza codificante per una lipoproteina di membrana che indirizza l'anticorpo a raggiungere lo spazio periplasmatico, dove la porzione Fc dell'anticorpo viene riconosciuta da una lipoproteina della membrana interna. I ceppi di E.coli utilizzati.

Per questa fase vengono ingegnerizzati al fine di esprimere questa lipoproteina di membrana che lega gli antigeni. Trattando questi batteri con un lisozima (EDTA), viene rimossa la membrana esterna. Poi si aggiunge l'antigene che dovrebbe essere riconosciuto dall'anticorpo prodotto dalla cellula. L'antigene viene marcato con un fluorocromo, in modo da poter riconoscere le cellule che presentano l'anticorpo di interesse legato alla membrana interna. In seguito dalle cellule selezionate si estrae il plasmide che viene fatto esprimere in ceppi di E.coli non ingegnerizzati. Da qui si ricavano gli anticorpi completi.

CLASSIFICAZIONE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI

Una prima suddivisione degli anticorpi monoclonali potrebbe essere la seguente:

• Anticorpi monoclonali nudi (ossia non coniugati ad altre molecole);
• Anticorpi monoclonali coniugati a farmaci o a isotopi radioattivi.

Con la coniugazione di uno o più farmaci agli anticorpi monoclonali è...

possibiledirezionare con estrema precisione quello stesso principio attivo verso il target diinteresse, evitando di coinvolgere anche altri distretti dell'organismo. In questo modo,si possono potenzialmente ridurre gli effetti indesiderati e aumentare le probabilità diefficacia terapeutica. La coniugazione di isotopi radioattivi agli anticorpi monoclonali,invece, è una tecnica che viene sfruttata soprattutto nella terapia antitumorale. Piùprecisamente, in questi casi si parla di radioimmunoterapia. Nel caso in cui glianticorpi monoclonali vengano applicati per il trattamento dei tumori, le celluletumorali devono essere prima trattate con un farmaco chemioterapico per indurre laproduzione di una proteina di membrana che verrà poi utilizzata per il legame conl'anticorpo monoclonale trasportante, ad esempio, l'isotopo radioattivo mirato controqueste cellule tumorali. Solitamente le tossine coniugate con questa tipologia dianticorpi derivano

dall’esotossina A di Pseudomonas, che presenta 3 domini: dominio di legame (grazie al quale la tossina riconosce e lega recettori della cellula ospite); dominio di traslocazione (che indirizza l’ingresso della tossina nella cellula); dominio di ADP-ribosilazione (che interferisce sulla crescita della cellule che è stata infettata). La tossina ricombinante che lega uno specifico anticorpo monoclonale mancante della porzione Fc richiama la struttura dell’esotossina A, infatti presenta i domini di traslocazione e di ADP-ribosilazione, ma il dominio di legame è sostituito con una sequenza composta da un dominio che riconosce la regione variabile della catena pesante e un domino che riconosce la regione variabile della catena leggera delle immunoglobulina. I due domini sono tra loro connessi da una regione linker.

ESOTOSSINA A

TOSSINA RICOMBINANTE

In altri casi gli anticorpi mirati contro i tumori possono non essere coniugati a tossine.