Anticorpi monoclonali - produzione e utilizzo in terapia

Anticorpi monoclonali

Gli anticorpi monoclonali sono anticorpi identici tra loro generati da un singolo clone cellulare (ossia da un singolo clone produttore di linfocita B) e che riconoscono lo stesso determinante antigenico. Il problema nella produzione di anticorpi monoclonali sta nell'utilizzo dei linfociti B stessi perché i linfociti B vivono pochissimo in vivo, non abbastanza per produrre anticorpi.

Il problema è stato risolto dal premio Nobel per la medicina – Kohler e Milstein (1984) che idearono un sistema per far produrre ai linfociti B degli anticorpi senza che questi morissero tramite la fusione dei linfociti B con una cellula tumorale (quindi, immortale), in particolare un mieloma (cellula tumorale del midollo osseo). La fusione si basa sul PEG (polietilenglicol), un composto chimico che permette la fusione delle membrane, oppure su un sistema di elettrofusione che consiste nell'esporre delle cellule in una piastra ad una differenza di potenziale che rompe temporaneamente le membrane delle cellule, aiutandone la fusione.

Si immortalizza, così, il linfocita B in modo che possa produrre a tempo indeterminato gli anticorpi di interesse -> generazione di ibridomi che possiedono le caratteristiche di entrambe le cellule:

• Sintesi anticorpi dei linfociti B
• Vita immortale e crescita indefinita propria delle cellule tumorali

Il linfocita B che utilizzo deve ovviamente essere sensibilizzato per l'antigene di interesse verso cui l'anticorpo che devo produrre deve essere specifico. Devo quindi esporre il topo ad un determinato antigene in modo che il topo cominci a produrre linfociti B competenti che andrò a prelevare dalla milza, un organo linfoide di stazionamento dei linfociti.

Bisogna poi individuare tra tutti i linfociti B che ho estratto dalla milza quel clone che produce l'anticorpo di mio interesse attraverso una selezione che utilizza un test ELISA. Dopo l'identificazione, le cellule di ibridoma corrette vengono perpetuate attraverso due sistemi:

• Cultura in bioreattori (più comodo ed economico oltre che non prevede l'uso di animali)
• Infetto il topo con l'ibridoma in modo che queste cellule continuino ad essere prodotte e poi isolo direttamente dal topo gli anticorpi (metodo usato in precedenza ma ora quasi del tutto sostituito da quello precedente)

Fasi di produzione di un anticorpo monoclonale

Immunizzazione animale e prelevamento delle cellule dalla milza

L'animale (generalmente un topo) viene esposto a dosi controllate dell'antigene verso cui voglio produrre l'anticorpo in modo ripetuto (basandosi sulla cinetica anticorpale) attraverso una somministrazione intraperitoneale:

• Giorno 0: 50 µg
• Giorno 14: 25 µg (dopo 14 giorni le IgG sono a livello minimo e, quindi, è necessario farle risalire)
• Giorno 28: 25 µg (come prima) + controllo per vedere se il topo sta producendo Ab di interesse (prelievo di sangue e test per la reattività dell'antigene)
• Trattamento (boost) finale con 10 µg 3 giorni prima della fusione

Segue isolamento delle cellule della milza.

Fusione

La fusione avviene attraverso due meccanismi:

• PEG (polietilenglicol): polimero chimico che favorisce la fusione delle membrane;
• Elettrofusione che consiste nell'esporre delle cellule in una piastra ad una differenza di potenziale che rompe temporaneamente le membrane delle cellule, aiutandone la fusione.

Tuttavia, la fusione non ha un'efficienza del 100% e, quindi, in seguito al processo si avranno 3 popolazioni cellulari:

• Linfociti B non fusi o fusi tra loro -> muoiono per senescenza in modo spontaneo
• Ibridomi -> quelle che mi servono
• Cellule di mieloma non fuse o fuse tra loro -> non mi servono, ma continuano a vivere

Devo quindi selezionare gli ibridomi attraverso un sistema che utilizza un mezzo detto HAT, cioè un mezzo di coltura che contiene:

• Aminopterina: inibitore della diidrofolato reduttasi responsabile della sintesi de novo degli acidi nucleici. Le cellule devono ricorrere, quindi, ad un'altra via (quella di salvataggio) per produrre le basi del DNA e potersi così riprodurre;
• Ipoxantina e timidina: precursori delle basi puriniche e pirimidiniche che attivano la via di salvataggio, cioè la via di sintesi di DNA non dipendente da diidrofolato reduttasi.

Le cellule di mieloma utilizzate sono cellule modificate per cui sono prive dell'enzima HGPRT (hypoxantine guanine phosphoribosil transferase) che consente la via di salvataggio attivata da ipoxantina e timidina perché permette di sintetizzare purine utilizzando ipoxantina esogena come precursore. Queste cellule, quindi, sintetizzano acidi nucleici solo de novo ma questa via è bloccata dalla presenza di aminopterina nel terreno di crescita.

Il linfocita B, invece, possiede l'enzima e quindi può utilizzare la via di salvataggio.

-> Cellule di mieloma non possono riprodursi, ma gli ibridomi sì perché si sono fusi con i linfociti B.

Isolamento del clone che produce l'anticorpo di interesse

Ciascuno degli ibridomi formati viene posto in un pozzetto in modo da ottenere cloni cellulari identici tra loro in ciascun pozzetto. Sulla piastra a pozzetti, viene poi effettuato il test ELISA che va ad individuare quale clone produce gli anticorpi diretti verso l'antigene di interesse.

Il test può essere fatto con due diverse modalità:

• Diretto (sandwich): si parte dall'anticorpo prodotto dal clone che viene immobilizzato nel pozzetto a cui si aggiunge l'antigene verso cui si vuole produrre l'anticorpo. Se nel pozzetto è presente l'anticorpo corretto, questo si legherà all'antigene, formando un complesso che successivamente andrà a legarsi all'anticorpo secondario aggiunto, provocando un cambiamento del colore del pozzetto.
• Indiretto: ciascun pozzetto ha già l'antigene immobilizzato, in modo che l'anticorpo prodotto dall'ibridoma possa legarsi ad esso se è quello giusto. Successivamente, si aggiunge l'anticorpo secondario.

Propagazione

• Nell'animale stesso;
• Nei bioreattori, strutture rotanti (favorisce l'ossigenazione e evita la precipitazione delle cellule) che permettono la crescita tridimensionale delle cellule.

-> Si ottiene un anticorpo monoclonale strutturalmente perfetto ma è di topo (problema perché scatena la risposta immunitaria del paziente se lo voglio usare in terapia).

Utilizzi

• Diagnostica, anche se a volte si usano i policlonali, per ELISA così da riconoscere antigeni in malattie infettive e marker tumorali;
• Ricerca: WB, immunocitochimica, FACS (citometria a flusso);
• Agricoltura: test di rivelazione che identificano i patogeni e le tossine nelle piante. Ci sono infatti tossine molto cancerogene come le aflatossine che vengono prodotte da piante infette (soprattutto mais);
• Tossicologia ambientale: identificazione inquinanti ambientali.

Anticorpi per la terapia

Poiché gli anticorpi murini non possono essere usati in terapia, è necessario produrre anticorpi umani. Gli Ab per terapia in commercio sono o chimerici o umanizzati, cioè Ab che presentano una parte di sequenze murine, mentre le porzioni legate alle sequenze variabili sono umane, mentre un solo tipo degli anticorpi in commercio con scopo terapeutico è un Ab interamente umano (cioè Ab interamente costituiti da sequenze umane).

Questo perché è difficile produrre anticorpi interamente umani in quanto sono proteine complesse con un preciso folding e costituite da più catene e la loro produzione in cellule non umane porta ad errori della struttura terziaria e quaternaria (fondamentali, però, per il funzionamento dell'anticorpo).

Inoltre, non è possibile utilizzare la stessa tecnica utilizzata per produrre anticorpi murini per due motivi:

• Non esiste nel campionario di linee di mieloma umano una linea che presenti caratteristiche di immortalità come quelle del mieloma murino e siano adatte ad essere ibridate;
• Il patrimonio genetico dei linfociti B umani è caratterizzato da instabilità genetica perché per loro natura le sequenze genomiche dei linfociti B tendono a ricombinare.

Gli anticorpi "umani" vanno quindi ricostruiti in vitro, integrando sequenze specifiche delle catene variabili leggere e pesanti con lo scheletro delle IgG umane attraverso operazioni piuttosto nuove. Si possono usare due tipi di anticorpi:

• Ab chimerici: si ottengono integrando l'intera sequenza variabile delle catene leggere e pesanti (cioè il dominio variabile che lega l'antigene) ad un dominio costante di una IgG umana;
• Ab umanizzati: si ottengono integrando quelle sequenze specifiche (non tutta la catena variabile leggere e pesante) del dominio variabile che legano l'antigene (CDR, complementary determining regions) murine sullo scheletro di IgG umane.

È stato possibile creare Ab chimerico e/o umanizzati solo dopo un certo momento. Gli studi sugli Ab murini risalgono al 1950. All'epoca però mancavano ancora tecniche fondamentali che consentissero l'integrazione di genoma umano e murino. Le tecniche necessarie, disponibili però solo dal 1985, erano la PCR e la tecnologia del DNA ricombinante, che dà la possibilità di ricombinare pezzi di genoma e integrarli nel genoma di altri individui, procariote o eucariote.

Nel 1993 si è arrivati anche alla produzione di Ab umani, privi di sequenza murina, utilizzando topi transgenici. Tuttavia, questa tecnologia tutt'ora non è molto utilizzata e, per questo, di Ab umani ce ne sono pochi in commercio.

Gli Ab CDR grafted sono una via di mezzo tra i chimerici e gli umanizzati: presentano sia le sequenze che legano gli epitopi sia altre sequenze flanking (=sequenze adiacenti) murine che vengono poi integrate su uno scheletro di IgG umana. Rappresentano un intermedio del passaggio da Ab chimerici ad Ab umanizzati che è stata un'integrazione dei due DNA, umano e murino, progressiva. Un esempio di questa classe è il trastuzumab.

Colture cellulari

Per cellule primarie si intendono cellule prese direttamente dal tessuto e si possono avere due tipi di colture cellulari: da tessuto normale e da tessuto tumorale.

L'utilizzo di colture cellulari ha sia vantaggi che svantaggi.

• Sistemi semplificati ed altamente riproducibili
• Consentono l'analisi dei meccanismi cellulari e molecolari del fenomeno in esame
• Controllo ambientale
• Economicità e rapidità di risposta
• Disponibilità
• Sistemi molto più semplici dell'organismo integrato
• Condizione di esposizione alle sostanze diverse da quelle in vivo
• Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo
• Le sostanze inoculate possono interagire con il terreno di coltura

Nel maneggiare colture cellulari è importante utilizzare tecniche sterili o asettiche per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da fonti esterne e per impedire la contaminazione di se stessi e/o di terzi.

Uno strumento molto utilizzato per garantire sterilità è la cappa a flusso laminare che garantisce principalmente la protezione del campione da contaminazioni, non la protezione dell'operatore e dell'ambiente. Il flusso laminare è un flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrati attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro e con la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/s. Questi filetti d'aria servono a trascinare lontano dall'area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazione di vortici. I filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air) prevengono la contaminazione particellare e sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte in modo da aumentare la superficie filtrante; l'efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 µm di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%.

I sistemi di crescita utilizzati sono di due tipi: sospensione e adesione. La sospensione viene utilizzata per cellule che normalmente vivono in un mezzo fluido (come cellule di origine ematopoietica). L'adesione viene utilizzata per cellule che in vivo fanno parte di tessuti solidi (cellule di origine nervosa, epiteliale e mesenchimale). È un fenomeno che richiede l'interazione di recettori di membrana (integrine) con proteine adesive (fibronectina), adsorbite sulla superficie della piastra di coltura; le cellule aderenti crescono fino ad occupare l'intera superficie disponibile e, a questo stadio (di confluenza) la crescita si arresta. Le cellule devono, quindi, essere staccate e trasferite in nuove piastre. Il distacco delle cellule dalla piastra in cui si trovano può essere fatto:

• In maniera meccanica (con scraper)
• Con EDTA che chela ioni calcio e magnesio indispensabili per l'adesione
• Con enzimi proteolitici, come la tripsina, che degradano le proteine della matrice.

In questi ultimi due casi, per permettere l'adesione della cellula in una nuova piastra si deve neutralizzare l'azione di EDTA e tripsina, aggiungendo al nuovo mezzo di coltura rispettivamente cationi bivalenti in eccesso ed inibitori della tripsina.

Il tempo necessario alle cellule per duplicarsi è di circa 20-24 ore a seconda del tipo cellulare. Sia per la coltura in adesione che per quella in sospensione (cioè in generale per la crescita cellulare in vitro) è necessario un terreno di coltura che comprende elementi nutritivi (glucosio, AA, sali minerali) e fattori di crescita (contenuti nel siero).

Siero: quello più comune utilizzato è il siero fetale bovino (FBS), una miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule. Contiene:

• Fattori di crescita: PDGF, EGF e IGF
• Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina
• Altri minerali: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi, glucorticoidi, elementi minerali.

I terreni usati differiscono tra loro per il contenuto in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosio; la composizione esatta dei singoli terreni ed il tipo di terreno adatto per una data linea cellulare viene di solito specificato dalla ditta produttrice.

Inoltre, per la crescita le cellule richiedono un valore di pH tra 7,2 e 7,4 che viene mantenuto costante ricorrendo a terreni con NaHCO₃ e incubatori con una fase gassosa del 5% di CO₂, riproducendo le naturali condizioni che si ritrovano all'interno dei tessuti (35-45 mmHg di pCO₂ che equivalgono al 4,6-5,9% di CO₂).

Per conservare cellule per lunghi periodi si ricorre allo stoccaggio in azoto liquido (-196 °C) che mantiene le cellule vive in completa quiescenza per anni. Tramite congelamento, quindi, si può costruire uno stock di cellule che mantengono le caratteristiche fisiologiche e biochimiche della cellula di partenza.

Il congelamento può però essere letale per le cellule a causa dei cristalli di ghiaccio che possono formarsi al loro interno in caso di congelamento troppo rapido e che, in fase di scongelamento, tendono a rompere la membrana. Per minimizzare questi effetti si possono prendere diverse precauzioni:

• Utilizzare agenti citoprotettivi in grado di abbassare il punto di congelamento, come il glicerolo e il DMSO. Il medium di congelamento solitamente usato è costituito da 90% siero e 10% DMSO; il congelamento viene fatto anche in presenza di terreno di crescita;
• Usare cellule in salute che stanno crescendo durante la fase logaritmica o che hanno già raggiunto la confluenza;
• Sostituire il medium 24 ore prima del congelamento;
• Portare lentamente le cellule dalla temperatura ambiente a -80 °C, al fine di permettere all'acqua di uscire dalle cellule prima del congelamento. Il tasso ottimale di raffreddamento è -3°C/min. Per regolare questo processo attraverso una periodica immissione di azoto liquido, si utilizzano le camere di congelamento.

Molto utilizzata come camera di congelamento è il Mr. Frosty, un contenitore riempito con 200 ml di isopropanolo a temperatura ambiente che serve a garantire che le vials (piccole boccettine di vetro o plastica), contenenti le cellule e posizionate in un rack (scaffale) all'interno del contenitore stesso, una volta che l'intero contenitore è stato posto in un freezer a -80 °C, raggiungano la temperatura di congelamento lentamente (circa 1°C al minuto). Una volta che il contenitore ha raggiunto la temperatura di -80 °C (in 4 ore o più), le vials vengono rimosse e poste immediatamente in azoto liquido.

Le cellule sono stoccate in azoto liquido poiché lo sviluppo di cristalli è ritardato al di sotto di -130 °C. Per massimizzare il recupero delle cellule dopo lo scongelamento, bisogna:

• Riscaldare le cellule molto rapidamente, posizionando le vials direttamente dall'azoto liquido nel bagnetto riscaldato a 37 °C;
• Diluire le cellule nel medium di coltura preriscaldato, non appena l'ultimo cristallo di ghiaccio si è sciolto.

Produzione di anticorpi chimerici/umanizzati

[Si basa sul concetto di clonaggio del DNA, un insieme di tecniche della biologia molecolare con cui è possibile ottenere più copie di una determinata sequenza nucleotidica. Il clonaggio prevede:

• Generazione di una molecola di DNA ricombinante, cioè una molecola di DNA isolata dal suo contesto ed introdotta in un replicone (unità di DNA in grado di replicarsi, detta vettore)
• Introduzione della molecola di DNA ricombinante in un sistema cellulare appropriato (in genere batteri derivati da E. Coli)
• Replicazione delle cellule in cui è stato inserito il DNA ricombinante in modo che tutti i discendenti della singola cellula (quindi il clone)