6. Bioluminescenza (luminometro, metodi immunobioluminescenti, turbidimetria e nefelometria)

Luminescenza

Come detto nel capitolo precedente, la luminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica, con lunghezza d’onda nel visibile, che avviene come conseguenza del passaggio da uno stato elettronico eccitato allo stato fondamentale di una determinata molecola. Sono noti molti tipi di luminescenza designati da prefissi che identificano la fonte di energia responsabile dell’eccitazione della molecola, e quindi dell’emissione di luce: bio-luminescenza, chemi-luminescenza, foto-luminescenza, elettro-chemiluminescenza, piro-luminescenza, radio-luminescenza, sono-luminescenza, termo-luminescenza. Nel capitolo precedente abbiamo fatto riferimento solo alla chemiluminescenza. Di seguito si fa riferimento alla bio-luminescenza.

Bioluminescenza

Quando una reazione chemiluminescente ha luogo in un organismo vivente, prende il nome di bioluminescenza. La bioluminescenza è legata soprattutto agli organismi marini, ma riguarda anche animali terricoli, ad esempio insetti, come le lucciole. Il fenomeno della bioluminescenza è diffuso anche in molti batteri, alcuni dei quali originano l’effetto “milky sea” (mare di latte) che si verifica soprattutto nell’Oceano Indiano, dove il mare assume una luminescenza intensa tale da conferirgli il colore bianco del latte.

Il principio alla base della bioluminescenza è lo stesso di quello della chemiluminescenza, in cui alcune molecole, prodotte in uno stato elettronico eccitato, emettono parte di energia sotto forma di radiazione luminosa tornando allo stato fondamentale. Se, però, l’efficienza quantica nel caso della chemiluminescenza aveva un valore massimo di 0,1, nel caso della bioluminescenza assume un valore compreso tra 0,1 e 0,9.

Nella maggior parte dei casi, sono coinvolti due composti chimici: un substrato organico che emette luce, chiamato luciferina (che è termostabile in presenza di ossigeno), e un enzima catalizzatore, chiamato luciferasi (che è termolabile). La luciferina è presente, oltre che nelle lucciole, anche nei batteri e nei dinoflagellati. La luciferasi può essere estratta, oltre che dalle lucciole (Photinius Pyralis), anche da batteri (come Vibrio fischeri, Beneckea harveyi ecc.) o da un mollusco (Pholas).

Nel caso della produzione di luce da parte delle lucciole, sappiamo che questo è un evento molto dispendioso da un punto di vista energetico: infatti, per ogni fotone di luce giallo-verde che viene prodotto si consuma una molecola di ATP. La reazione che produce luce nelle lucciole vede come attori principali l’enzima luciferasi e il substrato organico D-luciferina (DLH₂). La DLH₂ reagisce con l’ATP per formare il D-Luciferil-AMP, che, a sua volta, reagisce con l’ossigeno, scindendosi per formare AMP, anidride carbonica e l’ossiluciferina (OxyLH₂), che decadendo da uno stato eccitato nel quale si trova produce la ben nota luminescenza giallo-verde. La ossiluciferina è una molecola termolabile. L’ossiluciferina viene, poi, enzimaticamente ridotta a luciferina.

La reazione può essere così sintetizzata:

Luciferina + ATP + O₂ → Ossiluciferina + AMP + PP + fotone

Dal momento che questa reazione consuma molto ATP, può essere impiegata da un punto di vista clinico per misurare la concentrazione dell’ATP nelle cellule e per la misura di tutte le attività enzimatiche ATP-dipendenti (ATP-asi, CPK, esochinasi, piruvatochinasi ecc.). Queste metodiche vengono per lo più utilizzate per la valutazione della vitalità cellulare dal momento che solo le cellule vive contengono e consumano ATP. Una applicazione è la determinazione del contenuto di ATP negli spermatozoi umani correlato sia col numero che con la motilità degli spermatozoi. Il procedimento prevede l’estrazione dell’ATP dalle cellule considerate (mediante l’utilizzo di dimetilsolfossido; DMSO) e poi l’aggiunta di questo ATP a una miscela di reazione contenente i substrati ed enzimi essenziali a far avvenire la produzione di luce (luciferasi e luciferina estratte dalle lucciole). L’intensità della luce, misurata con un luminometro, è direttamente proporzionale alla concentrazione di ATP: dalla comparazione tra le letture del campione e quelle ottenute da soluzioni a concentrazione nota di ATP si risale alla concentrazione di quest’ultimo nel campione in esame.

Utilizzando la bioluminescenza e il sistema luciferina/luciferasi è possibile valutare anche la concentrazione dei microrganismi in un substrato (carica microbica) in base al consumo di ATP utilizzato nella reazione, a sua volta correlato al numero di microrganismi presenti. Anche in questo caso, viene misurata la concentrazione delle cellule vive, in quanto ovviamente in quelle morte non viene sintetizzato ATP.

Anche nei batteri la reazione biochimica avviene grazie alla luciferasi, che, questa volta, ossida un...