6. Bioluminescenza (luminometro, metodi immunobioluminescenti, turbidimetria e nefelometria)

FMN2

Durante questa reazione si forma flavin mononucleotide ossidato (FMN) in uno stato elettronicamente eccitato che emette luce quando torna nella sua condizione di base.

Dal punto di vista biochimico, la reazione è analoga a quanto avviene nella catena di trasporto degli elettroni, infatti gli elettroni sono trasferiti dal FMNH all'ossigeno molecolare che si riduce a formare l'acqua. L'FMNH può essere prodotto in seguito alla ossidazione del NADH o del NADPH secondo la reazione seguente:

NAD(P)H + H+ + FMN → NAD(P)+ + FMNH2

Per questo motivo, con l'impiego della luciferasi batterica è possibile eseguire la misura diretta o indiretta del NAD(P)H; tutte le reazioni chimico-cliniche accoppiate a reazioni NAD(P) dipendenti possono pertanto venire convenientemente misurate anche con questa tecnica.

La luminescenza dei microrganismi compare solo quando la densità cellulare è elevata perché il meccanismo molecolare che...

Il testo fornito descrive il processo di emissione di luce dipendente dalla presenza del lattone-N-acil-L-omoserina (AHL), un induttore che funziona come segnale chimico. Questo composto chimico si accumula e si diffonde da una cellula all'altra. L'induttore si lega alla proteina LuxR, formando un complesso che attiva l'espressione genica che porta alla sintesi di luciferasi e altre proteine coinvolte nel fenomeno.

Lo strumento utilizzato per misurare istantaneamente la luminosità emessa a seguito di questa reazione, che coinvolge ATP, luciferasi e luciferina di lucciola, prende il nome di luminometro. La luminosità viene convertita in un valore numerico riportato sul display di questo strumento.

Possiamo distinguere due tipologie di luminometro: il luminometro utilizzato per misurare il grado di contaminazione di una superficie o di acque e il luminometro per provette. La prima tipologia di luminometro è composta da una cella in cui si introduce un

viene inserito nel dispositivo e viene fatta scattare la valvola, ha inizio la reazione che porta alla produzione di luce. Un rivelatore trasforma questo segnale luminoso in segnale elettrico; mentre, un registratore misura il segnale in uscita; e un microprocessore misura l'ampiezza dell'emissione luminosa e l'integrale definito sotto la curva. Per capire cosa significa che il microprocessore misura l'integrale definito sotto la curva, dobbiamo partire dal concetto secondo il quale l'emissione della luce non è costante nel tempo, ma segue un andamento che può essere genericamente descritto dal modello che segue: Quello che vediamo è un tipico grafico dell'andamento della luminescenza. Si ha un picco massimo subito all'inizio della reazione per decadere poi nel tempo. Per calcolare la luminescenza, quindi, si va a calcolare l'integrale definito sotto la curva. L'integrale di una porzione rappresentativa dell'area.

sotto la curva (nell'immagine indicata con le linee diagonali) sembra essere un parametro in grado di fornire misure attendibili in un breve intervallo di tempo (10 secondi). Il valore numerico corrispondente all'integrale definito sotto la curva dell'andamento dell'emissione luminosa viene riportato sul display del luminometro. Più è elevata la contaminazione microbica, più sarà elevata la quantità di ATP raccolta e, di conseguenza, più elevata sarà la quantità di luce prodotta e il valore misurato dal luminometro.

Il luminometro per provette funziona nello stesso modo del luminometro visto precedentemente. In questo caso, però, è presente una camera in cui si inserisce una provetta contenente l'ATP estratto dalle cellule di interesse e i substrati e gli enzimi necessari a far avvenire la reazione.

METODI IMMUNOBIOLUMINESCENTI

I metodi immunobioluminescenti sono metodi immunologici in fase solida

(cioè l'antigene o l'anticorpo vengono fatti aderire su un substrato solido) che utilizzano traccianti bioluminescenti per il dosaggio di proteine, ormoni e farmaci. Uno tra i metodi immunobioluminescenti è il metodo EELIA (Enzyme Enhanced Luminescence ImmunoAssay).

EELIA - METODO

Questo metodo è stato sviluppato per il dosaggio della transferrina sierica, ma può essere applicato in generale per la misura di proteine nei fluidi biologici. In questo dosaggio, si usa come tracciante la transferrina marcata con piruvato chinasi. Quindi si va alla ricerca dell'anticorpo specifico per questo antigene all'interno del siero. Su una superficie di cellulosa microcristallina viene fatto aderire un anticorpo uguale a quello che si sta ricercando nel siero. Quindi, si procede in questo modo:

1. Al siero, nel quale è presente la transferrina e quindi anche l'anticorpo corrispondente, viene aggiunta la transferrina marcata con piruvato-chinasi.

Il tutto viene incubato per far si che la transferrina libera e legata alla piruvatochinasi leghi l'anticorpo corrispondente libero nel siero.

Dopo questa prima incubazione, viene aggiunta la fase solida (anticorpo specifico per la transferrina adeso a una cellulosa micocristallina). Il tutto viene incubato per far si che questo anticorpo adeso leghi il complesso anticorpo-transferrina marcata.

Dopo questa seconda incubazione, si centrifuga il campione e si elimina il surnatante.

Ora si effettua un lavaggio del pellet per rimuovere tutta la transferrina marcata che non si è legata.

A questo punto si esegue la misura della luminosità. La misura luminosa viene effettuata aggiungendo al sistema, ADP e fosfoenolpiruvato in presenza di luciferasi e luciferina. Quindi la piruvato chinasi produce ATP a partire da ADP e fosfoenolpiruvato. Quindi, la luciferina ha tutti i componenti necessari per produrre luce. L'intensità della luce è direttamente

La concentrazione di ATP è proporzionale alla concentrazione di piruvato chinasi. La piruvato chinasi è legata alla transferrina, che a sua volta ha legato l'anticorpo anti-transferrina presente nel siero. Quindi, la concentrazione di ATP rispecchia quella dell'anticorpo anti-transferrina presente nel siero.

La concentrazione di transferrina è inversamente proporzionale all'attività enzimatica. Quindi, la sua concentrazione nel siero viene determinata costruendo una curva standard. Utilizzando dei calibratori, ovvero delle sostanze che hanno una concentrazione crescente dell'antigene che si sta ricercando (transferrina in questo caso), si misura l'intensità luminosa di ciascun calibratore dopo aver trattato ciascuno di essi seguendo le fasi dal punto 1 al punto 4 sopra esposte. Conoscendo la concentrazione di transferrina di ogni calibratore, si riportano i dati.

dell'aluminosità di un calibratore e dalla concentrazione di transferrina di quel determinato calibratore all'interno di un grafico xy. Si ripete l'operazione per ogni calibratore e si uniscono i punti relativi all'aluminosità con quelli relativi alla concentrazione della transferrina e si ottiene la curva standard. Dopo aver misurato l'aluminosità di un determinato campione, per conoscere la concentrazione di transferrina in esso presente, si considera la curva standard: in base al valore ottenuto di intensità luminosa si va a ricercare la concentrazione di transferrina corrispondente a questa luminosità all'interno della curva.

TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA

Prima di descrivere la turbidimetria e la nefelometria è bene specificare in cosa consiste l'assorbimento, la riflessione e la diffusione della luce. L'assorbimento è la capacità di un materiale di assorbire l'energia associata alle

radiazioni elettromagnetiche che si propagano all'interno di esso. Si tratta dell'energia dei fotoni che viene ceduta agli elettroni, atomi e molecole del materiale. In pratica, in seguito al passaggio di un raggio luminoso attraverso un determinato materiale, l'intensità luminosa si riduce, cioè non tutta la luce attraversa quel determinato materiale.

L'assorbimento dipende sia dalla frequenza della radiazione, sia dalla natura del materiale. Pertanto, l'assorbimento di un materiale è spesso utilizzato per conoscere la natura del materiale stesso.

La riflessione è il fenomeno per cui un'onda, quando colpisce l'interfaccia tra due differenti mezzi, cambia direzione e torna nel mezzo di provenienza. La lunghezza d'onda dell'onda riflessa è uguale a quella dell'onda incidente.

La diffusione della luce, nota anche con il nome di scattering, è un fenomeno che consiste nella riemissione in molte

Direzioni (solitamente non casuali) di un fascio di luce che colpisce un insieme di particelle disperse e di grandezza variabile presenti in un sistema che può essere allo stato solido, liquido o gassoso.

Una tecnica che sfrutta l'assorbimento dei raggi luminosi per determinare il livello di torbidità di un liquido prende il nome di turbidimetria. La turbidimetria viene applicata quando la dimensione delle particelle che provocano torbidità è dell'ordine o superiore al micrometro, condizione nella quale l'assorbimento prevale sulla diffusione.

L'intensità luminosa di un raggio che attraversa un fluido torbido (senza deviare dalla sua direzione) subisce un progressivo indebolimento, che può essere espresso mediante una funzione esponenziale: -adI=I *100

"I" è l'intensità luminosa uscente dal fluido, "I" è l'intensità luminosa entrante.