3. Genetica dello sviluppo e del differenziamento, sistema ematopoietico con esperimenti di KO

Associazione fisica e regolazione dei geni

L'associazione fisica è un modo per regolare i geni, per cui ci si chiede cosa controlli questa associazione fisica. Sono stati condotti degli studi sul fattore di trascrizione EKLF, scoperto come fattore trascrizionale eritroide-specifico che lavora sul promotore del gene β-globinico umano. Era stato osservato che esistono delle mutazioni puntiformi nella sequenza del promotore del gene globinico che sono associate alla talassemia, in cui il promotore funziona di meno o per niente, è stato uno dei primi casi in cui si è iniziato a capire che le mutazioni che generano una patologia possono trovarsi anche nelle regioni regolative.

Il fattore EKLF è un attivatore trascrizionale e lega specificamente due sequenze chiamate CACCC-boxes nel promotore del gene β-globinico. I topi privati di EKLF non esprimono il gene β-globinico e muoiono in fase fetale, quindi EKLF è stato definito un fattore trascrizionale critico per l'attività.

del gene globinico. I topi-/-EKLF non esprimono il gene β-globinico e in più la riduzione dell'espressione del gene γ-globinico avviene più lentamente. L'idea è che EKLF svolga un ruolo nella competizione tra il gene β e il gene γ per l'LCR. Si è ipotizzato che EKLF fosse importante anche per l'interazione tra il promotore di β e l'LCR. Sono state studiate le interazioni tra i geni globinici di topo, in particolare β-major, con le regioni ipersensibili, confrontando topi wild-type e topi knock-out per EKLF. Nelle cellule wild-type il gene β-globinico, preso come frammento di riferimento, interagisce con l'LCR e i siti ipersensibili al 5' e 3'. Nelle cellule con la delezione di EKLF il profilo diventa più simile a quello delle cellule di controllo del cervello, il gene β-globinico interagisce poco con l'LCR e i siti ipersensibili. Lo stesso si osserva quando siprende come riferimento un sito ipersensibile all'interno dell'LCR, nelle cellule senza EKLF l'interazione con il promotore del gene β-globinico e con i siti regolatori 5' e 3' è drasticamente ridotta. Quindi in assenza di EKLF l'organizzazione spaziale del cluster dei geni globinici e delle regioni regolative, quindi la struttura del chromatin hub è alterata. In un altro esperimento sono stati utilizzati come frammenti di riferimento quello che comprende il sito ipersensibile in 5' e quello che comprende l'LCR. Si mette in evidenza che la compromissione dell'associazione fisica nei knock-out di EKLF è più grave per il gene β-globinico rispetto che per la regione 3'. Nei knock-out si vede nessuna associazione né della regione 5' né dell'LCR con il gene β-globinico mentre l'associazione con la regione 3' rimane invariata. Vuol dire che quello che

più risente dell’assenza di EKLF è il promotore del gene globinico mentre gli enhancer lontani, come la regione 3’, rimangono associati. Quindi ci sono interazioni che dipendono di più da certi fattori trascrizionai e interazioni che dipendono di meno.

EKLF potrebbe avere un effetto diretto sul DNA, legando direttamente o tramite altri fattori trascrizionali il promotore e gli enhacers e tenendoli associati, oppure potrebbe avere un effetto indiretto, es. attivando un gene che codifica per una proteina che media l’interazione.

Per capire se l’effetto di EKLF è diretto o indiretto si è visto se l’effetto di EKLF richiede nuova sintesi proteica, cioè la sintesi di un’altra proteina, oppure no.

È stato generato un costrutto con un transgene codificante per EKLF sotto il controllo di un promotore eritroide forte e dell’LCR, con cui è stato realizzato un topo transgenico. Incrociando due topi

eterozigoti33per il knock-out di EKLF, di cui una figlio di un topo portatore del transgene, si ottiene una progenie in cuialcuni embrioni sono omozigoti per il knock-out di EKLF e in più portano il transgene.Il fattore EKLF espresso dal transgene è una proteina di fusione con il dominio di legame dei recettori degliestrogeni, per cui rimane a livello citoplasmatico e solo quando si fornisce 4-idrotamoxifen (4-OHT) vienetraslocato nel nucleo. Quello che si osserva è che nel momento in cui si aggiunge il farmaco EKLF traslocanel nucleo, il promotore del gene globinico viene reclutato nel chromatin hub che diventa attivo e siosserva un aumento dell’espressione genica del gene β-globinico. L’attivazione genica della trascrizione vain parallelo con l’associazione nell’active chromatin hub.In seguito si è provato a fornire insieme al tamoxifen un altro farmaco CHX che inibisce la sintesi proteica. Ilrisultato è stao che anche

in presenza dell'inibitore della sintesi proteica sia la trascrizione genica sia l'associazione fisica tra il gene e l'LCR rimangono elevate, in accordo con l'ipotesi che EKLF abbia un effetto diretto sul chromatin hub, non mediato dalla sintesi di un'altra proteina.

I risultati di questi esperimenti mostrano che il chromatin hub si forma anche in assenza di EKLF, ma quando si aggiunge EKLF viene reclutato anche il promotore del gene globinico e il chromatin hub diventa attivo, quindi EKLF è richiesto per la progressione dal chromatin hub del progenitore eritroide all'active chromatin hub della cellula eritroide differenziata. EKLF non è invece richiesto per l'espressione della α-globina.

Ci si è poi chiesti quali fossero le sequenze di DNA necessarie per formare l'active chromatin hub, quindi per determinare l'associazione tra l'LCR e il gene globinico. Sono stati realizzati dei transgeni con tutto

Il cluster dei geni β-globinici umani in cui sono state prodotte delle piccole delezioni mirate con una tecnica che permette di mutagenizzare il transgene in diversi modi. In seguito si è comparata l'attività dei geni β-globinici e l'associazione con l'LCR nei topi con il transgene wild-type e in quelli con il transgene con le diverse mutazioni, le misurazioni sono state fatte negli eritrociti maturi del periodo tardo fetale-adulto, in cui sono molti espressi i geni globinici adulti e poco i geni fetali.

Nel primo transgene è stato deleto il tratto -139 +49 (rispetto al punto di inizio della trascrizione TSS) nel promotore del gene β-globinico, la prima ipotesi era che fosse il promotore a interagire con l'LCR, in realtà si è visto che, anche se il promotore è in parte deleto, l'interazione tra il gene β e l'LCR non viene persa, viene solo ridotta del 30%, vuol dire che solo in parte.

l'interazione con gli altri geni globinici. Tuttavia, l'acetilazione degli istoni e l'ipersensibilità alla DNAsi dell'LCR e del sito 3' permangono. Nel caso in cui venga deletato HS3, si osserva una diminuzione dell'acetilazione degli istoni e dell'ipersensibilità alla DNAsi dell'LCR e del sito 3'. Questo suggerisce che HS3 è coinvolto nella regolazione epigenetica e nell'associazione del chromatin hub. In conclusione, l'interazione e la regolazione dei geni globinici dipendono dalla presenza di specifici elementi regolatori come i promotori e gli HS dell'LCR. La loro delezione può influenzare l'espressione genica e le modificazioni epigenetiche, ma non compromette completamente l'interazione tra i geni globinici e la formazione del chromatin hub.

L'espressione degli altri geni globinici. Se invece viene deleto HS3 si osserva che le interazioni che formano il chromatina hub vengono perse, l'espressione dei geni globinici è drasticamente ridotta, si perde l'acetilazione degli istoni e l'ipersensibilità alla DNAsi dei siti ipersensibile dell'LCR. Vuol dire che è il sito HS3 l'unico fondamentale per assemblare e per tenere insieme fisicamente il chromatin hub.

Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription NATURE GENETICS, Organizzazione dei geni eritroidi, sullo stesso cromosoma a elevata distanza. Sul cromosoma si trovano i geni globinici, Erat e Uros, la distribuzione nel nucleo, viene studiata relativamente al DNA usando la DNA-FISH e mediante lo studio del trascritto primario di RNA, mediante RNA-FISH, entrambe tecniche che richiedono l'utilizzo di sonde che possono essere riconosciute. Nel primo esperimento è condotta RNA-FISH con

L'utilizzo di sonde introniche per visualizzare l'attività trascrizionale di Uros, nell'immagine, i nuclei sono esemplificativi di 3 situazioni diverse, il nucleo a dx, sta trascrivendo entrambi gli alleli di Uros (entrambi i segnali), il nucleo centrale solo un allele, mentre il nucleo a sx nessuno. È possibile anche quantificare il fenomeno, ovvero capire quale è la proporzione degli alleli trascritti per determinati geni nella cellula, per quanto riguarda i geni globinici, la maggior parte degli alleli è trascritta in un certo momento, l'80-90% dei nuclei trattati con FISH, mostra entrambi i cromosomi trascritti, in generale, molti geni vengono trascritti in maniera discontinua. Queste sonde di FISH sono state usate per studiare la localizzazione dei geni che vengono trascritti nelle cellule. Nell'esperimento seguente, di DNA-FISH sono state impiegate due sonde, marcate con fluorocromi verde, β-globina e rosso, Eraf, oltre ai geni.

viene visualizzato un segnale di immunofluorescenza, blu, di un anticorpo diretto contro la RNApol II, si tratta di RNA-immuno-FISH che ci permette di visualizzare i genitrascritti insieme alla localizzazione della RNApolII, la quale presenta una clusterizzazione, si localizza in aggregati più densi. Disposizione relativa dei geni espressi nella cellula, sono presenti segnali sia rossi che verdi, sovrapposti a un addensamento di P II, (a) molto spesso i geni espressi nella cellula colocalizzano con il focus di pol II e tra loro, mentre l'allele di Eraf che non viene trascritto, non colocalizza né con gli altri geni, né con la RNAP II(b). Misurando la distanza tra i loci dei geni Hbb e Eraf, si nota che questa è più bassa quando si trovano colocalizzati con pol II, rispetto a quando non lo sono, quindi i geni trascritti tendono a colocalizzare (c). Se conto i foci, addensamenti locali di RNApol II nel nucleo, sono dell'ordine dei 200-300,

Paragonandolo al numero di geni espressi nello stesso tipo di cellule, che sono circa 4000, deduco che il numero di foci di polII è nettamente minore del numero di geni trascritti, quindi i geni trascritti spesso colocalizzano, vengono a trovarsi nello stesso microambiente nucleare.