3. Genetica dello sviluppo e del differenziamento, sistema ematopoietico con esperimenti di KO

Tessuto ematopoietico

Regolazione genica

Regolazione dei geni che codificano le catene globiniche dell’emoglobina. I geni globinici sono stati i primi ad essere studiati per quanto riguarda la loro regolazione nel corso dello sviluppo e differenziamento, i primi ad essere clonati in topo e uomo, sono esemplificativi per lo studio dell’espressione genica e della regolazione genica tessuto-specifica; questi geni, infatti, sono attivi solo nelle cellule eritroidi e a livelli elevati, sono dotati di una espressione specifica, sia per il tessuto che per le fasi dello sviluppo. In fasi diverse, sono espressi geni diversi.

L’emoglobina è formata da due catene α e due non α, codificate da due gruppi di geni diversi, posizionati diversamente sui cromosomi. Sono presenti più geni di tipo α e più geni di tipo β diversi tra loro. Guardando il cluster dei geni β, ci sono geni differenti, ε, Gγ, Aγ, ψβ (pseudogene non più funzionale), δ e β, che codifica per la catena β dell’emoglobina adulta, codifica per una catena β-like presente nell’emoglobina adulta minore, presente nel 2% del totale. I geni ε, Gγ, Aγ codificano per un’emoglobina β-like espressa nella vita fetale, mentre δ codifica per l’emoglobina fetale; questi geni sono presenti nel genoma nello stesso ordine in cui vengono attivati e disattivati durante lo sviluppo.

La trascrizione di ε è attiva nelle fasi precoci dell’embriogenesi, poi la sua sintesi decresce fino ad annullarsi nella sesta settimana, quando si attiva la produzione di emoglobina γ, che rimane attiva fino alla nascita, quando c’è lo switch delle globine, il decremento delle catene γ e l’incremento delle catene β. Nella vita post-natale si ha una produzione massima di catene β e una produzione bassissima di globine di tipo γ; una piccola quota di emoglobina fetale nell’adulto si trova nelle cellule F. Nell’adulto si ha anche una bassa produzione di emoglobina δ, che va a costituire l’emoglobina adulta minore. In associazione, i geni che codificano per le globine α sono attivati massimamente nelle prime settimane di vita, alla sesta settimana raggiungono livelli massimali che mantengono per tutta la vita; precedentemente è prodotta la ζ globina, allo stadio embrionale, dove svolge il ruolo di globina α-like.

I geni gamma differiscono per una sola base, funzionano allo stesso modo e sono similmente regolati.

L’eritropoiesi avviene in distretti diversi dell’organismo a seconda della fase dello sviluppo: nell’embrione comincia nel sacco vitellino, nei vasi dove sono prodotti i primi eritrociti, poi migra nel fegato e nella milza, fino al momento della nascita in cui il midollo osseo diventa l’organo ematopoietico principale, con un contributo dato dalla milza.

Questi geni originano per duplicazione e divergenza nel tempo che permette a ciascun gene di acquisire caratteristiche diverse dal gene di partenza e utili se usate in combinazione.

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Come funziona l’attivazione di diversi geni nel corso dello sviluppo?

Lo studio dei geni globinici è diventato la ricerca delle loro sequenze regolative. Il promotore si sapeva essere importante, quindi sono stati studiati i promotori dei geni globinici, ma regioni regolative importanti della trascrizione erano regioni che nella cromatina risultavano ipersensibili alla DNAasi.

Quando un gene è acceso trascrizionalmente, le sue regioni regolative sono accessibili all’attività della DNAasi. Il DNA nel nucleo è associato a proteine istoniche; nelle regioni regolative questa associazione è meno forte. Quando i fattori trascrizionali interagiscono con le loro sequenze specifiche, questo antagonizza un’interazione dello stesso DNA con il rocchetto istonico, l’equilibrio viene spostato verso l’interazione con il fattore trascrizionale.

Per individuare queste sequenze, si compie un saggio di accessibilità su nuclei purificati delle cellule, trattando la cromatina con quantità limitate di DNAasi, che andranno a digerire solo i tratti più accessibili. La DNAasi non è specifica, digerisce il legame tra un nucleotide e l’altro. A questo punto deproteinizzo la cromatina, purifico il DNA, separandolo da DNAasi, istoni e proteine associate; il DNA ottenuto lo digerisco con enzimi di restrizione, come EcoRI, di cui conosco i siti di taglio lungo il genoma. Migro i frammenti tramite elettroforesi in un saggio di Southern blot e vado ad analizzare il filtro con una sonda marcata, complementare ai tratti di DNA. Laddove non c’è sensibilità alla DNAasi, ottengo un frammento di lunghezza conosciuta, dato dal taglio di EcoRI; se c’è, trovo un frammento più corto, significa che c’è stato il taglio della DNAasi, quindi ottengo la posizione di una regione candidata come regione regolativa. Posso impiegare questo metodo su tratti specifici o sull’intero genoma di una cellula.

Nel cluster dei geni β-globinici sono siti sensibili alla DNAasi presenti in tutti gli stadi dello sviluppo e altri che variano nei vari stadi; tutti sono osservati solo nelle cellule eritroidi. I siti ipersensibili che si trovano a monte di tutti i geni globinici sono presenti negli eritroblasti in tutti gli stadi di sviluppo, mentre i siti sensibili sui promotori sono presenti solo nello stadio dello sviluppo in cui il gene che controllano viene espresso.

β-talassemie da delezione

Evidenze importanti derivano dallo studio delle talassemie e delle loro basi molecolari. Le talassemie sono malattie in cui il rapporto alfa/non alfa è diverso da 1; la perdita di un tipo di catene causa l’instabilità e la precipitazione del tetramero formato dalle catene restanti. Nella β-talassemia c’è un decremento o una perdita della produzione di catene β, il tetramero α⁴ precipita. Le talassemie sono malattie importanti, nelle quali l’emivita dei globuli rossi è ridotta, l’eritropoiesi è spinta ma inefficace; è un problema ancora attuale in quanto individui eterozigoti per la mutazione perdita di funzione del gene β sono diventati molto comuni a causa della malaria che conferiva agli individui β⁰ talassemici un vantaggio in condizioni malariche.

Identificare le regioni regolative dei geni globinici ha portato ai primi successi nella terapia genica della β-talassemia, introducendo nei pazienti privi di beta funzionale un transgene aggiuntivo correttamente regolato in termini qualitativi e quantitativi.

La β-talassemia consegue in una mutazione nel gene strutturale della β-globina; l’allele più diffuso in Italia è la mutazione β39, che causa la formazione di un codone di stop che interrompe la sintesi della catena. Ci sono talassemie più rare, risultate interessanti per la localizzazione di elementi regolatori importanti per la trascrizione del gene globinico: sono le δβ-talassemie o γδβ-talassemie, in cui ci sono cromosomi mutati in cui il gene β è presente e strutturalmente normale come sequenza e, se clonato a valle di un promotore, funziona correttamente.

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Tutti i pazienti affetti da queste forme di δβ-talassemie, olandese, inglese e spagnola, presentano una compromissione nell’attività di δ, β e γ. La variante olandese presenta la delezione più lunga, mentre la variante spagnola la delezione minore; è in questa variante che vado alla ricerca di ciò che accomuna queste patologie. In questa regione deleta potrebbe esserci un gene o un enhancer importante per l’attivazione di tutti i geni globinici in CIS sul cromosoma. Sono risultati informativi pazienti rari, doppi eterozigoti per δβ-talassemia spagnola, che portano sull’altro cromosoma la mutazione βS dell’anemia falciforme. In una persona con la delezione δβ-spagnola su un cromosoma o su entrambi, non si può capire se la delezione del gene β avviene in CIS sullo stesso cromosoma o nell’altro cromosoma; non lo posso capire perché il gene β successivo alla delezione è strutturalmente normale, non posso distinguere la sintesi di β globina, proveniente dal cromosoma deleto da quella proveniente dal cromosoma non deleto.

Se la delezione agisce rimuovendo un gene il cui prodotto è importante nel controllo dell’attività di β, mi aspetto che agisca anche in TRANS, su entrambi i cromosomi, in quanto un regolatore è una proteina diffusibile; mentre se la mutazione agisce rimuovendo un enhancer, che non attiva più il gene vicino, mi aspetto che venga ridotta l’espressione solo del gene sullo stesso cromosoma. Gli individui con la mutazione eterozigote della globina βS sono stati essenziali nell’identificare che il gene β in CIS alla delezione era silente, mentre βS era funzionante, questo grazie al fatto che l’emoglobina βS poteva essere identificata, quindi la mutazione agiva in CIS.

Nella δβ-talassemia spagnola, a seguito della delezione, vengono persi molti siti ipersensibili alla DNAasi, tranne 1 che però non risulta più ipersensibile quando il tratto viene perso. Sul cromosoma normale c’è un grado di sensibilità alla DNAasi globalmente maggiore rispetto a quello di regioni adiacenti non trascritte, normale in quanto la polimerasi deve interagire. Nel cromosoma dove era presente la delezione, tutta la regione dei geni globinici, anche se presente, era più compatta, si trovava in una conformazione più eterocromatica, veniva persa la sensibilità generale, l’ipersensibilità delle regioni regolative e l’iperacetilazione degli istoni tipica delle regioni regolative; la replicazione del DNA in corrispondenza dei geni globinici diventava più tardiva.

Dopo queste osservazioni su cellule umane, si è impiegato un modello di topo transgenico. I geni globinici di topo e uomo sono simili e vengono regolati in maniera simile, anche per quanto riguarda lo sviluppo e lo switch globinico; anche nel topo è presente a 5’ una regione ricca di siti ipersensibili alla DNAasi.

È stato quindi costruito un transgene con i geni globinici umani e inserito nel genoma di topo. Innanzitutto si è visto che il cluster dei geni umani si adattava ai tempi dello sviluppo del topo; un primo transgene conteneva il gene β-globinico umano con il suo promotore (1). Per ottenere vari topi transgenici, il prodotto veniva espresso in maniera eritroide specifica, quindi il promotore contiene l’informazione per dirigere l’espressione tessuto-specifica; aveva però un livello di espressione molto basso, le istruzioni per i livelli di espressione non erano presenti. Si ricercano altre sequenze ipersensibili; era noto da studi precedenti che una regione ricca di siti ipersensibili e che agiva in CIS era importante per l’espressione dei geni globinici. Si clona la sequenza a monte del gene (2) e si ottiene un costrutto con espressione eritroide specifica e molto elevata, a livelli paragonabili a quelli del gene endogeno. In questo modo è stato scoperto un enhancer importante che stimola l’attività dei geni; inoltre, la stimolazione era indipendente dal sito di integrazione, viene definita come LCR (locus control region), position independent, mentre l’espressione è copy number dependent, proporzionale al numero di copie di transgene che si integra. È la prima definizione di LCR.

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Esperimenti di transgenesi nei topi

Dopo che è stata identificata la Locus Control Region (LCR) a monte del cluster dei geni β-globinici, è stata caratterizzata attraverso esperimenti di transgenesi nei topi. È stato investigato come LCR sia un potente enhancer dei geni β-globinici in cis, sullo stesso cromosoma, e ne controlli l’espressione differenziata nel tempo e nello spazio.

Sono stati fatti diversi tipi di esperimenti transgenici in cui la regione LCR veniva transfettata insieme al gene β-globinico umano nel topo; il transgene veniva espresso nelle cellule eritroidi a livelli elevati comparabili all’espressione del gene endogeno in modo indipendente dal sito di integrazione nel genoma. Mentre se veniva transfettato solo il gene β-globinico l’espressione era specifica nelle cellule eritroidi ma a livelli molto minori, 1% dell’espressione del gene endogeno.

In seguito sono stati fatti altri esperimenti di transgenesi per studiare come LCR regoli l’espressione dei geni globinici β e γ; si era visto infatti che la delezione del LCR ha conseguenze sull’espressione dei 3 geni globinici β, γ e δ, sebbene i geni siano intatti e funzionanti.

• Sono stati realizzati dei transgeni con i soli geni globinici strutturali β e γ, guidati solo dal proprio promotore; si è osservata un’espressione bassa del gene γ durante lo sviluppo embrionico-fetale e del gene β nell’età adulta, la specificità verso il tipo cellulare eritroide e verso il periodo di espressione, stadio embrionico-fetale o adulto, è mantenuta. Vuol dire che ci sono sequenze regolative nei singoli geni che permettono l’espressione nel tipo cellulare e nello stadio corretto.
• Poi si è studiata l’espressione dei geni globinici associati alla LCR con i 5 siti ipersensibili alla DNAasi in costrutti contenenti la LCR, il promotore e uno dei due geni γ o β; l’espressione è stata misurata nello stadio embrionico-fetale e adulto. Nel primo caso è stato osservato che il gene γ è espresso ad alti livelli nello stadio fetale e a bassi livelli nello stadio adulto, regolazione quasi corretta, mentre nel secondo caso il gene β è espresso ad alti livelli sia nella vita adulta sia nella vita fetale, regolazione fetale errata.
• In un altro costrutto è stata ricreata la struttura presente sul cromosoma, con LCR, gene γ e gene β e i loro promotori. In questo caso l’espressione è corretta: γ è espresso ad alti livelli nello stadio fetale e poi viene spento, regolazione più corretta rispetto al costrutto con LCR e gene γ da solo, mentre β è espresso ad alti livelli nella vita adulta, come succedeva nel costrutto con solo il gene β e LCR, ma in questo caso nella vita fetale non viene espresso, regolazione corretta. Vuol dire che i due geni insieme permettono una regolazione più corretta. Vuol dire che c’è una qualche competizione tra i due geni per lo stesso LCR, perché se presenti insieme piuttosto che da soli sono regolati in modo più corretto.
• Nel topo e nell’uomo l’ordine dei due geni è conservato; se vengono scambiati i due geni, l’espressione di γ rimane corretta, mentre β viene espresso a bassi livelli anche durante la vita fetale, regolazione più corretta rispetto al costrutto con LCR e gene β da solo, ma meno corretta rispetto al costrutto in cui i due geni sono nell’ordine giusto. Vuol dire che l’ordine dei geni rispetto a LCR conta.
• Nell’ultimo costrutto il gene γ porta la mutazione puntiforme sul promotore che nell’uomo è associata alla HPFH, persistenza ereditaria dell’emoglobina fetale nella vita adulta. Si vede come γ è espresso ad alti livelli nella vita fetale e persiste nella vita adulta; l’espressione del gene β in cis viene in parte ridotta nella vita adulta. In individui β-talassemici con questa mutazione al gene γ la condizione patologica è meno grave, perché l’assenza di β viene in parte bilanciata dalla persistenza di γ. La mutazione puntiforme γ HPFH è l’unica differenza tra il gene malato e il gene sano; queste mutazioni puntiformi sono presenti solo nei malati e se vengono transfettate nei topi determinano la persistenza dell’emoglobina fetale. Si è ipotizzato che queste mutazioni determinino una maggiore affinità del promotore di γ per gli attivatori o una minor affinità per i repressori; un’altra ipotesi è che determinino una maggiore attivabilità del gene da parte della LCR. Quest’ultima ipotesi sembra supportata dal fatto che nell’ultimo costrutto il gene β è espresso di meno rispetto allo stesso costrutto con il gene γ normale, quindi la mutazione puntiforme sembra dare un vantaggio al gene γ nella competizione per l’attivabilità da parte della LCR.

Sono state formulate diverse ipotesi: secondo alcune la LCR attiva la cromatina globalmente, i singoli geni dipendono ognuno dai suoi fattori e sono trascritti insieme più o meno a seconda dei propri fattori; secondo altre la LCR interagisce con un solo gene alla volta, quindi quando su un cromosoma viene trascritto il gene β non è trascritto il gene γ e viceversa, vuol dire che la trascrizione dei due geni si esclude a vicenda.

Sono state studiate le cellule eritroidi perinatali in fase di switch, quando esprimono tutti e due i geni. Si studiano le cellule di fegato fetale nel topo, le cellule fetali nel momento dello switch nell’uomo oppure le F-cells nell’uomo adulto.

Come si può studiare l’espressione simultanea dei due geni? Si è utilizzata la FISH (Fluorescence in situ Hybridization) con sonde marcate con fluorocromi verdi o rossi. Le sonde sono dirette verso gli introni del trascritto primario dei geni β e γ, perché il trascritto primario ha vita breve, di pochi minuti, viene subito processato con la rimozione degli introni, mentre il trascritto maturo ha un’emivita molto più lunga, fino a ore. Le sonde introniche permettono di visualizzare se il cromosoma è marcato in rosso o in verde a seconda di quale dei due geni viene trascritto in quel momento. Viene usato un topo transgenico omozigote per il costrutto transgenico contenente il gene β e γ