5 a Proteine eterologhe: produzione di p. Eterologhe nei lieviti saccharomycaes; produzione di p. Eterologhe in cellule di insetto; produzione di p. Eterologhe in cellule di mammifero+ il bacmide + purificazione p. Eterologhe

PROTEINE ETEROLOGHE

Una proteina è definita eterologa quando non viene prodotta nel suo organismo

naturale, ma in un altro organismo. Per poter inserire un gene, ad esempio eucariotico,

all’interno di una cellula ospite, ad esempio un batterio, bisogna ricombinare un

vettore con un gene che codifica per la proteina di interesse. I vettori utilizzati per

questo scopo prendono il nome di vettori di espressione. Affinché il gene di

interesse venga espresso, esso deve essere integrato nel vettore di espressione

insieme al suo promotore e alle sequenze regolatrici della trascrizione. La produzione

di grosse quantità di proteine eterologhe può, tuttavia, avere effetti tossici o rallentare

il metabolismo delle cellule ospiti. Per ovviare a questi problemi è vantaggioso

utilizzare un promotore inducibile, cioè promotori che vengono attivati solo in

presenza di determinati stimoli e di conseguenza anche la trascrizione e traduzione

del gene regolato da questo promotore dipenderanno da questi stimoli. La produzione

di proteine eterologhe per mezzo di vettori di espressione ricombinanti è l’unico modo

per creare una grande quantità di proteine di interesse farmaceutico, come l’insulina.

In questo modo, quindi, è possibile soddisfare il fabbisogno mondiale di proteine, cosa

che non sarebbe possibile isolando la proteina di interesse dalla sua fonte naturale.

Quest’ultimo procedimento, oltre a non essere adatto per soddisfare il fabbisogno

mondiale di una determinata proteine, risulta essere caratterizzato anche da elevati

costi. La produzione di proteine eterologhe è importante perché si possono produrre

ormoni, anticorpi, fattori della coagulazione e antigeni per la creazione di vaccini. Le

proteine eterologhe vengono prodotte anche con lo scopo di studiarne la struttura. A

volte la molecola da studiare non è tanto la proteina prodotta da un determinato gene

quanto l’RNA da esso trascritto.

E’ necessario scegliere in quale organismo si vuole produrre la proteina: gli ospiti

E. coli Saccharomyces cerevisiae

principali sono (un batterio molto conosciuto), Drosophila

(un lievito simile a quelli usati per fare il pane), cellule di (moscerino della

Chinese hamster ovary

frutta), (cellule di criceto cinese) e cellule vegetali di

tabacco. Le cellule batteriche hanno caratteristiche che le rendono dei buoni sistemi

cellulari per la produzione di proteine ricombinanti: crescono rapidamente e possono

facilmente essere amplificate in terreno liquido, con bassi costi di produzione. I batteri

offrono molti vantaggi per esprimere proteine eterologhe, ma hanno anche delle

limitazioni. Ad esempio, molte proteine animali, soprattutto quelle dei mammiferi,

hanno dimensioni di gran lunga maggiori rispetto alle proteine batteriche e non

possono essere facilmente sintetizzate da E. coli: questa difficoltà di sintesi di proteine

eucariotiche da parte di E.coli si traduce con la produzione di proteine che hanno una

configurazione spaziale errata e, pertanto, queste vengono inglobate in vescicole,

chiamate corpi di inlcusione. I corpi di inclusione sono delle vescicole insolubili che

si formano nelle cellule batteriche con lo scopo di inglobare sostanze nutritive che si

presentano in abbondanza. E’ importante che le sostanze in eccesso siano contenute

in queste vescicole perché se fossero disperse nel citoplasma ci sarebbe un

innalzamento della pressione osmotica con conseguenti eventi sfavorevoli come il

richiamo di acqua dall’esterno e possibile lisi della cellula stessa. Nel caso della

produzione di proteine eterologhe, i corpi di inclusione conterranno le proteine che

hanno assunto una errata configurazione spaziale. Le proteine eucariotiche nel loro

organismo di origine spesso subiscono delle modificazioni post-traduzionali, che

risultano essenziali per la funzionalità della proteina stessa; i batteri però mancano

degli enzimi in grado di introdurre queste modificazioni e quindi proteine di questo

tipo, una volta tradotte all’interno di cellule batteriche, si dimostrano poco stabili, o

con ridotte attività biologiche. Molte volte, proprio perché i batteri non possiedono i

sistemi enzimatici in grado di produrre modificazioni importanti per le proteine,

vengono utilizzate cellule di mammifero come quelle dei criceti cinesi che sono più

simili alle cellule umane. L’inconveniente delle cellule di mammifero, rispetto ad un

batterio, è la minore produzione di proteina e la maggiore complessità nelle tecniche

di coltivazione e di purificazione. Chiaramente questo causa un incremento dei costi

delle proteine ricombinanti e di purificazione.

Tra le modifiche post-traduzionali che le proteine eucariotiche subiscono, le più comuni

sono la glicosilazione, la proteolisi e la fosforilazione. In alcuni casi queste

modifiche post traduzionali sono attuate da diversi enzimi; in altri casi sono le proteine

stesse ad avere la capacità di apportare autonomamente tali modifiche. La

GLICOSILAZIONE è un complesso sistema di modificazione che può avvenire sia co-

che post-traduzionalmente. Esistono sostanzialmente due tipi diversi di glicosilazione:

la N-glicosilazione e la O-gliosilazione. La N-glicosilazione si realizza tramite

l’aggiunta di una catena glucidica all’atomo di azoto di una catena laterale di

asparagina e, negli eucarioti, ha inizio nel reticolo endoplasmatico quando la proteina

è ancora in fase di sintesi. Il primo evento consiste nel legame di una catena di 14

zuccheri (2 molecole di N-acetilglucosammina, 3 di glucosio e 9 di mannosio) a un

residuo laterale di asparagina. L’oligosaccaride è trasferito come unico elemento

dall’azione dell’enzima glicosil-transferasi. Dopo l’attacco, la catena glucidica può

essere ulteriormente modificata eliminando alcuni residui di zuccheri. Le proteine che

hanno subìto l’attacco della catena glucidica e la sua successiva modificazione sono

poi trasportate all’apparato di Golgi. Qui subiscono una serie di ulteriori modificazioni

che sono specifiche per ciascuna proteina. La O-glicosilazione si svolge nell’apparato

di Golgi, dove vari zuccheri possono legarsi alla proteina a livello dell’ossigeno delle

catene laterali di residui di serina e treonina. Viene aggiunto uno zucchero alla volta e,

solitamente, il numero di molecole di zucchero aggiunte nel processo è limitato a

pochi residui. Gli zuccheri che vengono aggiunti a una proteina possono avere diverse

funzioni: una funzione di targeting, cioè indirizzano la proteina su specifici siti cellulari;

una funzione di riconoscimento, cioè nel momento in cui le glicoproteine fungono da

recettori, lo zucchero supporta il legame con il ligando; una funzione di stabilizzazione,

cioè gli zuccheri stabilizzano la proteina proteggendola dalla proteolisi; una funzione di

solubilizzazione, cioè aumentano la solubilità della proteina (glicoproteine private dei

loro zuccheri possono diventare insolubili); la glicosilazione determina anche

l’aumento della vita biologica di una proteina, ritardando la rimozione dal flusso

sanguigno. La glicosilazione delle proteine è una modifica che, in realtà, oltre a

verificarsi nelle cellule eucariotiche, si realizza anche nelle cellule procariotiche dove è

legata alla loro patogenicità e all’invasione dell’ospite.

La FOSFORILAZIONE di proteine è la modificazione post-traduzionale più frequente

nel proteoma degli eucarioti. E’ stato valutato che circa un terzo delle potenziali

proteine del proteoma umano sono fosforilate e che esistono circa 500 enzimi in grado

di fosforilare le proteine e 150 capaci di defosforilarle. Gli enzimi fosforilanti sono

chiamati proteine chinasi (PK), mentre quelli che defosforilano sono chiamati

fosfatasi. La fosforilazione di proteine avviene anche nei procarioti, anche se è

estremamente più abbondante negli eucarioti. Le proteine chinasi catalizzano il

trasferimento di un gamma-fosfato dall’ATP su un residuo di serina, treonina o tirosina

con liberazione di ADP. A seconda del residuo fosforilato possiamo distinguere le

chinasi in 3 categorie: serina/treonina chinasi; tirosina chinasi; chinasi a doppia

specificità in grado di fosforilare tutti e tre i residui. La prima categoria è la più

abbondante. Anche se meno frequente, la fosforilazione su tirosina non è meno

importante. L’introduzione di un gruppo fosfato nella struttura terziaria di una proteina

crea l’opportunità di creare nuovi appaiamenti elettrostatici e legami idrogeno che

possono determinare una riorganizzazione locale della proteina anche molto

drammatica. Inoltre, l’introduzione di un gruppo fosfato può essere riconosciuta da

altre proteine che hanno dei domini specifici per riconoscere proteine fosforilate. Ne

deriva che la fosforilazione è una delle modificazioni post-traduzionali più rilevanti per

modulare le interazioni proteina-proteina nella cellula: questo spiega perché la

fosforilazione gioca un ruolo così rilevante in praticamente tutte le vie di trasduzione

dei segnali.

Alcune modificazioni post-traduzionali sono irreversibili e l’esempio più classico

consiste nel processamento di proteine tramite rottura del legame peptidico

catalizzata da enzimi detti proteasi. La modificazione prende, quindi, il nome di

proteolisi. Molte proteine non vengono prodotte in forma attiva, ma viene prodotto

un loro precursore che, in seguito all’azione di una proteasi che rimuove una porzione

di questo precursore, si attiva. Un esempio di precursore proteico che viene attivato in

seguito a proteolisi è il precursore dell’ormone insulina, che prende il nome di

preproinsulina. La preproinsulina contiene all’estremità amminoterminale un tratto

idrofobico (chiamato sequenza segnale), alla quale fanno seguito tre regioni indicate

con le lettere A, B e C. La sequenza segnale dirige la proteina nel lume del reticolo

endoplasmatico, dove è convertita in proinsulina, mediante eliminazione proteolitica

della sequenza segnale. La proinsulina è poi trasportata nell’apparato di Golgi e nei

granuli secretori, dove la regione C di connessione tra la regione A e B è anch’essa

eliminata e i due segmenti A e B sono connessi tra loro, tramite due legami disolfuro, a

costituire l’insulina matura che viene secreta.

PRODUZIONE DI PROTEINE

ETEROLOGHE IN CELLULE DI

LIEVITO SACCHAROMYCES

I lieviti sono un gruppo di funghi, formati da un unico tipo di cellula eucariotica, che

possono avere forma ellittica o sferica. I primi esperimenti sulle proteine eterologhe

Saccharomyces

vennero fatti utilizzando proprio una cellula di lievito, il lievito

Cerevisiae , per vari motivi:

Perché è un organismo molto semplice e molto conosciuto,

 Perché non è dannoso per l’uomo: è infatti utilizzato anche per la fermentazione

 della birra, del pane, ecc.;

Perché è facilmente coltivabile;

 Perché non è esigente dal punto di vista nutrizionale;

 Perché conosciamo l’intero genoma e la sua fisiologia;

 Perché presenta al suo interno dei promotori forti, che possono essere utilizzati

 per far controllare l’espressione del gene esogeno;

Perché, essendo eucariote, è capace di effettuare numerose modificazioni post-

 traduzionali, importanti per rendere la proteina eterologa attiva dal punto di

vista funzionale;

Perché secerne poche proteine all’esterno e se la proteina eterologa viene fatta

 fuoriuscire sarà facile recuperarla nel mezzo di coltura poichè non ce ne

saranno altre: questo è senza dubbio un vantaggio, perché nel momento in cui

si dovrà effettuare la purificazione della proteina eterologa sarà piuttosto

agevole.

I principali vettori di espressione che vengono utilizzati per trasfettare cellule di lievito

sono:

1. Yeast Episomal Plasmid (YEp) o vettori episomiali di lievito. Questi

vettori sono molto diffusi, ma presentano una importante controindicazione:

risultano instabili per la produzione di quantità di proteina eterologa maggiore ai

10 litri. Come qualsiasi altro vettore, anche i plasmidi episomiali sono

caratterizzati da un insieme di siti di restrizione unici e, come nel caso del

plasmide pUC19, questi siti sono condensati in un’unica regione che prende il

nome di Multiple Cloning Site (MCS). A fianco a questa regione è presente

un promotore forte (p) da un lato, mentre dall’altro è presente una sequenza

di arresto e di poliadenilazione. In questo vettore è, inoltre, presente una

origine di replicazione tipica dei lieviti e un gene marcatore selezionabile come

URA3, LEU2, TRP1.

2. Yeast Integrating plasmid (YIp) o vettori integranti di lievito. La

limitazione di questi vettori è data dal fatto che possono ospitare un solo gene e

di conseguenza si avranno rese basse per quanto riguarda le quantità di

proteina eterologa prodotta. Si è pensato di creare una sequenza contenente

tante copie di uno stesso gene disposte in tandem (una di seguito all’altra) per

aumentare la resa, ma il vettore risulta instabile. I plasmidi YIp non hanno

un’origine di replicazione e, pertanto, non possono replicarsi autonomamente.

Di conseguenza vengono per lo più persi dalla cellula nel corso delle divisioni

cellulari, a meno che non vengano integrati da qualche parte in uno dei

cromosomi di lievito. Infatti questi vettori sono progettati proprio in modo tale

da poter rendere possibile l’integrazione del gene che codifica per la proteina

eterologa all’interno del genoma di lievito e, precisamente, all’interno di una

sequenza di un gene non essenziale per il lievito. Come qualsiasi altro vettore,

anche questo è progettato con dei siti di restrizione unici e dei geni marcatori

selezionabili (URA3, LEU2, TRP1). La peculiarità di questi vettori è quella di

presentare delle sequenze omologhe a sequenze del genoma di lievito. Le

sequenze omologhe alL’interno del vettore sono poste in modo