4. Ciclo replicativo virale: le fasi

Come si è originato il virus della SARS? L’ospite che ha trasmesso il virus all’uomo è lo zibetto, un

animale simile al procione, molto utilizzato in Cina, ed in realtà si è scoperto che questo non è altro

se non l’ospite intermedio, infatti indagando un ampio numero di zibetti si è visto che il virus non è

tanto diffuso negli animali; si è così scoperto che il serbatoio naturale è rappresentato dai pipistrelli

frugivori sia dell’Africa che di regioni molto lontane. Mentre l’omologia tra SARS umano e quello

dei pipistrelli è del 79%, tra il virus umano e quello dello zibetto c’è un’omologia del 99%. Il RBD

(Receptor Binding Domain) si trova sulla glicoproteina della spicola ed ha una struttura abbastanza

conservata. I vari antirecettori riconoscono recettori diversi sulle cellule dell’ospite: il virus umano e

quello dello zibetto riconoscono come recettore l’ACE2, una metalloproteasi, mentre il virus dei

pipistrelli riconosce un altro recettore, quindi questo significa che l’antirecettore si è modificato.

Questa immagine ci dice quanto poco basti per far avvenire il cambiamento: basta la mutazione di

due aminoacidi in posizioni ben precise per cambiare l’affinità dell’antirecettore per il recettore

ACE2. Questo dimostra come negli stessi siti del recettore cellulare, in base agli aminoacidi

presenti, il virus della SARS umana ha un’affinità molto maggiore per l’ACE2 sia rispetto allo

zibetto che rispetto a quella dell’epidemia dell’anno successivo, oltre che essere completamente

diversa rispetto al pipistrello. Il salto di specie può essere quindi determinato da piccolissimi

cambiamenti che nei Coronavirus sono molto frequenti.

Molti virus, soprattutto quelli più grossi, possono utilizzare dei recettori diversi da quello che

utilizzano solitamente, e questo aumenta il target di cellule che il virus può infettare: HIV ad

esempio ammette una notevole lista di recettori, e sebbene nessuno sia efficiente quanto il CD4,

garantiscono al virus una maggiore probabilità di successo rispetto alla terapia farmacologica.

Anche gli Herpesvirus possono utilizzare tanti recettori diversi grazie all’ampio corredo proteico

presente sulla superficie dell’envelope. All’alto numero di recettori e corecettori corrisponde una

vasta gamma di cellule che può essere infettata da HIV. Ad aumentare le capacità dei virus di

infettare le cellule si aggiunge il fenomeno di INGRESSO ASPECIFICO, che si verifica quando il

virus viene legato da anticorpi ma questi non sono i veri e propri anticorpi neutralizzanti (quelli che

effettivamente sono in grado di eliminare l’infettività del microrganismo attraverso diversi

meccanismi); in questo caso l’immunocomplesso si lega sulla superficie di macrofagi e cellule

presentanti l’antigene, interagendo con il recettore per gli anticorpi (frammento FC), attivando la

fagocitosi e permettendo l’ingresso del virus nella cellula. Non essendo anticorpi neutralizzanti,

all’interno del macrofago i virus non vengono degradati ma si replicano portando a patologie. Un

esempio importante, in quanto è una minaccia virologica, è rappresentato dal virus della Dengue,

un virus trasmesso da zanzare (Arbovirus più diffuso al mondo) e responabile di due patologie

molto diverse: una banale forma febbrile con forti dolori alle ossa (febbre “spacca ossa”) ed

eventuali esantemi cutanei, nonchè una grave forma di febbre emorragica non molto diversa da

quella scatenata dal virus Ebola, che porta a morte abbastanza in fretta. Perché si possono avere

queste due forme patologiche? Perché esistono quattro sierotipi diversi di Dengue, ciascuno dei

quali induce una risposta immunitaria specifica: quando un individuo si infetta per la prima volta

con uno di questi quattro sierotipi sviluppa la forma febbrile blanda e risulta immunizzato contro

quel determinato sierotipo; gli anticorpi contro un sierotipo reagiscono anche contro gli altri

sierotipi, nei confronti dei quali però non sono neutralizzanti, quindi se si va incontro ad infezione

con un sierotipo diverso dal primo, gli anticorpi preformati si legano al nuovo virus ma non lo

neutralizzano ed i macrofagi, inglobandolo in quantità notevole, potenziano l’ingresso aspecifico e

comportano una loro disregolazione con un’enorme produzione di citochine pro infiammatorie

(comprese molecole vaso attive) che determinano un aumento della permeabilità dei vasi

sanguigni e gravissime emorragie.

• PENETRAZIONE ED UNCOATING

Una volta che il virus si è attaccato alla cellula, deve entrare al suo interno, e questo è possibile

grazie ad una serie di modificazioni della membrana e della particella virale stessa; la

penetrazione, in alcuni virus è quasi simultanea all’uncoating (uncoating precoce), mentre per altri

avviene in fasi più tardive, e prevede la spogliazione del virus, la perdita delle sue componenti

proteiche e la liberazione dell’acido nucleico.

La PENETRAZIONE sfrutta i meccanismi della cellula come la fusione di membrane o la

formazione di vescicole endocitiche, ma essendo dei meccanismi funzionali della cellula, richiede

che questa sia metabolicamente attiva, e può avvenire quindi a 37°. In alcuni casi l’uncoating è

precoce perché una volta entrato nella cellula l’acido nucleico è già libero, mentre ad esempio nei

virus a DNA l’uncoating è estremamente tardivo perché tutti i virus a DNA si replicano nel nucleo,

dove trovano gli enzimi necessari a questo processo. La trascrizione è sempre operata, per i virus

a DNA, dalla RNA polimerasi 2 cellulare; alcuni virus inoltre non hanno la capacità di sintetizzare

una loro DNA polimerasi, ed a maggior ragione necessitano di arrivare intatti nel nucleo. I

Poxvirus, però, sintetizzano autonomamente la DNA polimerasi e quindi rimangono nel citoplasma;

tutti i virus a RNA si replicano e trascrivano invece nel citoplasma, con due eccezioni, i Retrovirus,

che si dirigono immediatamente al nucleo in quanto una volta entrati nella cellula diventano a DNA,

e gli Ortomyxovirus. L’UNCOATING si realizza grazie a diversi parametri, tra cui l’abbassamento

del pH e l’acidificazione dell’ambiente in cui si viene a trovare il virus, favorendo l’idrolisi acida

delle proteine, o l’intervento di proteasi virali o cellulari, anch’esse attivate dal pH acido. In alcuni

casi i processi di trascrizione del virus iniziano prima ancora che l’uncoating sia completato, in

quello che viene definito capside “parzialmente digerito”, in cui si sono persi dei pezzi e lo si è reso

permeabile ai nucleotidi; in questo microambiente il virus risulta protetto e le prime fasi della

trascrizione sono avvantaggiate.

Come i virus entrano nella cellula? Attraverso la fusione e l’endocitosi.

- FUSIONE, tipica dei virus con envelope e di alcuni virus nudi che compiono una fusione

parziale con la membrana per la formazione di un canale. Questo tipo di penetrazione

prevede che il virus si avvicini tanto in modo da far sì che i due strati fosfolipidici (envelope

e membrana) si uniscano e che l’envelope diventi un pezzo di membrana cellulare; in realtà

la fusione può avvenire sia a livello della membrana citoplasmatica, mentre altri virus

entrano prima per endocitosi e solo successivamente l’envelope del virus si fonde con la

membrana dell’endosoma liberando il capside. Nel processo di fusione sono fondamentali

le proteine FUSOGENE, che sono quelle responsabili dell’avvicinamento delle due

membrane e possono essere separate dall’antirecettore (nel caso ad esempio di HIV la

GP120 è l’antirecettore e la GP41 è la proteina fusogena), oppure essere la stessa proteina

che funziona anche come antirecettore (HA dei virus influenzale). Le proteine di fusione

devono essere regolate, e questa regolazione è attuata in diversi modi: la GP41 è impedita

nella sua azione per il fatto che una sua porzione, il peptide di fusione, viene mascherata

dalla GP120 in condizioni normali. Il PEPTIDE DI FUSIONE è una sequenza aminoacidica

altamente idrofobica che può interagire con il doppio strato fosfolipidico. La HA invece lega

l’acido sialico, uno zucchero presente in tutte le cellule, tuttavia i virus influenzali possono

penetrare solo nelle cellule dell’apparato respiratorio perché solo a questo livello è presente

la triptasi CLARA. L’interazione recettore-antirecettore può avvenire a livello della

membrana citoplasmatica oppure a seguito dell’endocitosi. Altro meccanismo di controllo

delle proteine di fusione è il pH: si distinguono proteine pH dipendenti (che agiscono nel

caso di endocitosi seguita da fusione) e pH indipendenti (che determinano la fusione a

livello di membrana citoplasmatica). L’acidificazione può rappresentare l’inizio

dell’uncoating.

L’ingresso dei virus influenzali avviene mediante l’iniziale interazione tra HA ed acido

sialico, che attiva la formazione di una vescicola di endocitosi e, contemporaneamente o

poco dopo, si ha l’intervento della triptasi CLARA che taglia all’altezza del colletto causando

il distacco della testa globulare ed esposizione del peptide di fusione che entra nel doppio

strato lipidico della membrana citoplasmatica. La modifica conformazionale della HA

determina già l’avvicinamento delle due membrane lipidiche in quanto, perdendo la testa

globulare, si è accorciata, ma questo non basta, infatti è necessaria una ulteriore

modificazione della HA, dovuta ad abbassamento del pH, per permettere l’ingresso del

virus nella cellula e completare la fusione. Una volta che l’envelope si è fuso con la

membrana dell’endosoma, dal momento che nel virione dei virus influenzali è presente

anche la matrice, costituita dalla proteina M1, ed una proteina transmembrana M2 che

mette in comunicazione l’interno del virus con l’esterno, il processo diventa più complesso.

Il problema dei virus influenzali è che la proteina M1 svolge molto bene la funzione di

ancoraggio del capside all’envelope, ma questo legame deve essere risolto affinchè il

capside venga liberato nel citoplasma; per degradare la M1 si sfrutta la proteina M2, infatti

+

questa è un canale ionico che fa entrare nel virus gli ioni H , acidificando anche l’interno

della particella virale, oltre a quello dell’endosoma, e permettendo l’idrolisi acida di M1

(alcuni farmaci anti influenzali bloccano la proteina M2 impedendo la prosecuzione del ciclo

virale). Cosa significa “fusione delle membrane”? Inizialmente le due membrane sono

separate, ma con l’abbassamento del pH si ha l’attivazione