14 Terreni di coltura e loro componenti

TERRENI DI COLTURA

Il substrato più frequentemente utilizzato per la crescita dei microrganismi è il terreno di coltura. Il terreno colturale deve fornire al microrganismo tutte le sostanze nutritive necessarie alla crescita, alla produzione di energia e alla biosintesi dei metaboliti desiderati. Deve quindi contenere opportune fonti di carbonio e di azoto, nonché sali inorganici, vitamine o altri fattori di crescita ed eventuali nutrienti precursori. Tutti questi componenti prendono il nome di terreno di coltura. La composizione di un terreno colturale, in funzione del microrganismo impiegato, può essere più o meno semplice o complessa. In base alla costituzione chimica, quindi, i terreni possono essere distinti in terreni minimi (o anche detti terreni generici o terreni di base) che sono utilizzati per la crescita dei soli batteri autotrofi e sono composti solo da elementi essenziali, come fosforo, azoto, carbonio (anidride carbonica) e zolfo, i quali componenti.

Sono presenti come Sali inorganici e vengono utilizzati dai batteri autotrofi per sintetizzare autonomamente le sostanze nutritive di cui hanno bisogno; terreni sintetici (o anche detti terreni definiti), ovvero terreni dei quali si conosce la formulazione chimica di ogni ingrediente; terreni complessi ovvero terreni di cui è ignota l'esatta composizione chimica delle sostanze nutritive. I terreni complessi risultano di estrema utilità in quanto permettono di crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro o specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute. Questi terreni solitamente contengono materie prime in forma grezza, quali farine di origine vegetale o animale, acqua di macerazione del mais, melasso ecc. Gli ingredienti in forma grezza possono richiedere pretrattamenti, per esempio l'idrolisi (come nel caso dell'amido, o anche nel caso della cellulosa ecc.), prima di essere impiegati per la preparazione.

del terreno. I terreni complessi presentano il vantaggio di essere più economici di quelli sintetici. In base allo stato fisico, i terreni di coltura possono essere distinti in terreni di coltura liquidi (in cui i componenti sono sciolti in acqua e sterilizzati) e terreni di coltura solidi (che possono essere naturalmente solidi come, ad esempio, la patata che può essere utilizzata come terreno di coltura o possono essere resi solidi i terreni liquidi grazie all'aggiunta di agar agar all'1,5%). Nell'ambito dei terreni solidi, in realtà, si può fare una distinzione tra terreni solidi propriamente detti (cioè quelli che sono di per sé solidi) e terreni solidificabili (cioè, come detto, terreni solidi ottenuti per aggiunta di agar a terreni liquidi). I terreni solidi sono ormai in disuso; i terreni solidificabili sono per lo più utilizzati per la conta cellulare (ad esempio, per la conta delle unità formanti.

colonie). In base alla funzione, i terreni possono essere distinti in terreni di arricchimento (o anche detti elettivi) che permettono la crescita cellulare di un determinato ceppo microbico; terreni selettivi, che contengono sostanze batteriostatiche che inibiscono o rallentano la crescita di specifiche cellule mentre sono indifferenti per la crescita di altre. Tra le sostanze batteriostatiche aggiunte nei terreni selettivi si annoverano l'actidione e l'acido ascorbico (entrambi inibiscono la crescita dei funghi). La selettività può essere ottenuta anche tramite fattori ambientali come temperatura, pH ecc.

Una cosa molto importante da fare è cercare di mantenere il pH del terreno entro certi valori desiderati. Il monitoraggio del valore del pH può essere effettuato addizionando il terreno di composti come il rosso fenolo, un indicatore di pH che è giallo a pH 6.5, arancio a pH 7.0, rosso a pH 7.6 e violaceo man mano che si sale.

metabolismo+attivo delle cellule in coltura produce grandi quantità di ioni H che provocano in poche ore una eccessiva acidificazione del terreno di coltura, se non viene aggiunto un tampone. Un sistema tampone è un dispositivo chimico che è in grado di mantenere un predeterminato pH nonostante si verifichino grandi variazioni della concentrazione degli ioni H. Il sistema tampone più usato nella coltura delle cellule è quello a base di 3-carbonato (cioè HCO3-)/bicarbonato (HCO3-): HCO3- + H+ ⇌ H2CO3 ⇌ H2O + CO2 Il carbonato cede protoni H+ al gruppo idrossile OH- neutralizzandolo e trasformandolo, quindi, in acqua; mentre il bicarbonato funge da accettore di ioni H+, che vengono liberati dal metabolismo cellulare, formando carbonato. Attraverso questo meccanismo viene mantenuto stabile il pH del terreno di coltura.sono utilizzati come substrati per i processi fermentativi. Questi carboidrati vengono metabolizzati dai microrganismi attraverso reazioni enzimatiche che producono energia e composti di interesse industriale, come ad esempio l'acido lattico o l'etanolo. *CARBOIDRATI IN FORMA GREZZA Le fonti di carbonio grezze, come ad esempio la cellulosa o l'amido, richiedono un trattamento preliminare per renderle utilizzabili dai microrganismi. Questo trattamento può consistere in processi di idrolisi enzimatica o di pre-trattamento chimico, al fine di rompere le catene di carboidrati complesse e renderle accessibili agli enzimi fermentativi. *FONTI NON CARBOIDRATICHE Oltre ai carboidrati, esistono anche altre fonti di carbonio utilizzabili dai microrganismi per i processi fermentativi. Queste fonti possono essere di origine lipidica o proteica. Ad esempio, gli oli vegetali possono essere utilizzati come substrati per la produzione di biodiesel, mentre le proteine possono essere utilizzate per la produzione di aminoacidi o di altri composti di interesse industriale. In conclusione, le fonti di carbonio utilizzabili per i processi fermentativi sono molteplici e possono essere classificate in base alla loro forma (pura o grezza) e alla loro origine (carboidratica o non carboidratica). L'utilizzo di queste fonti di carbonio rinnovabili è di fondamentale importanza per lo sviluppo di processi sostenibili e rispettosi dell'ambiente.

Non hanno trovato largo impiego, soprattutto in passato, nei processi fermentativi su larga scala. Solo in tempi recenti, lo sviluppo di processi biotecnologici basati sull'impiego di enzimi ha reso disponibili sciroppi di glucosio, a costo contenuto, ottenuti per idrolisi diamido.

Le forme di carbonio in forma grezza più comunemente impiegate sono il melasso (di barbabietola o di canna), il corn molasse, il liscivio solfitico, l'orzo maltizzato, il siero di latte e i residui cellulosici. Il melasso è un sottoprodotto dell'industria saccarifera (cioè che produce zucchero). Lo zucchero può essere prodotto a partire dalle barbabietole o dalla canna da zucchero. La produzione di zucchero a partire dalla canna da zucchero, ad esempio, prevede il susseguirsi di diverse fasi. Dapprima le canne devono essere sfogliate. La canna da zucchero, privata delle foglie, viene sottoposta a lavaggi multipli per eliminare le scorie ed i parassiti.

Quindi le canne vengono tagliate e sottoposte all'azione di coltelli rotanti per essere sminuzzate. Dopo queste operazioni i ritagli di canna vengono ripetutamente sottoposti a fasi alterne di macerazione in acqua e torchiatura meccanica da rulli fino all'estrazione per spremitura di una soluzione (detta melassa o "sugo") contenente circa il 10-15% di saccarosio. Il "sugo" così ricavato è pronto per la fase di raffinazione. I sughi sono ricchi di impurità e presentano una colorazione intensa: il sugo di canna è verde-nero, quello di barbabietola è blu-nero. Con la raffinazione (altro non è che una depurazione) si ottiene un sugo giallo più o meno intenso. Questo viene sciolto facendone un sciroppo contenente circa il 60% di saccarosio. Tramite apposite apparecchiature, il sciroppo viene poi cristallizzato. Lo zucchero ottenuto dalla cristallizzazione è di un colore giallo più o meno carico; dato chel'industria alimentare e il consumatore richiedono uno zucchero bianco, occorre un processo di decolorazione. Con il termine back-strap-molasses si identificano i melassi indipendentemente dalla loro origine, barbabietola o canna. In realtà, con il termine molasses black si identificano i melassi da barbabietola, mentre con il termine strap quelli di canna. I melassi costituiscono una fonte di fattori di crescita fondamentali per molti processi fermentativi, quali l'acido pantotenico, l'inositolo e la biotina. In particolare, i melassi di barbabietola e di canna differiscono per il contenuto di biotina, che è significativamente più elevato nel melasso di canna. Per tale motivazione il melasso di canna viene addizionato a quello di barbabietola, come fonte di biotina. Il termine melasso, come detto, si intende, in senso stretto, il residuo finale della cristallizzazione del saccarosio, da barbabietola o da canna da zucchero. In realtà con tale processo si ottiene uno zucchero grezzo, che necessita di ulteriori trattamenti per ottenere uno zucchero bianco.

Il termine "corn molasse" (o hydrol) viene spesso utilizzato impropriamente per identificare altri sottoprodotti o residui di processi estrattivi per l'ottenimento di zuccheri diversi dal saccarosio. Questo termine deriva dal processo di produzione del glucosio estratto dall'amido di mais. Anche questo sottoprodotto, come il melasso derivante dalla produzione di saccarosio, ha un colore bruno, è viscoso e ha un sapore amaro, che ne limita l'applicazione in campo alimentare. È caratterizzato da un elevato contenuto di zuccheri, associato a un elevato contenuto di proteine e a un'elevata concentrazione di sali.

Il liscivio solfito è il residuo del processo di produzione della cellulosa dall'legname. Il liscivio solfito contiene zuccheri fermentabili come glucosio, mannosio, galattosio, xilosio e arabinosio. Quando il liscivio contiene prevalentemente esosi, può essere utilizzato come substrato per il lievito.

Saccharomyces cerevisiae, mentrequando prevalgono i pentosi, si utilizza il liscivio per Candida utilis, che ha la capacità di utilizzare sia gli esosi che i pentosi. L'estratto di malto è ottenuto da orzo sottoposto a maltizzazione. Il malto è il chicco di un cereale, quale l'orzo. Questi chicchi vengono utilizzati per la produzione di birra, però gli zuccheri in essi contenuti non sono immediatamente accessibili. Per questo il malto subirà il processo di maltazione. Bisogna, cioè, far germinare i chicchi, disponendoli in appositi tini dove essi assorbono acqua. In questo modo i chicchi germinano e, cioè, da essi spuntano delle piccole radici. Durante la germinazione vengono attivati enzimi (amilasi) che riducono, ad esempio, l'amido in molecole più semplici, quali destrine, che a loro volta verranno ridotte in unità disaccaridiche, ciascuna dett