12. L'immobilizzazione cellulare e i bioreattori appositi per cellule immobilizzate

BIOREATTORI PER CELLULE IMMOBILIZZATE

Per massimizzare la ritenzione della biomassa entro il reattore bisogna evitare che le cellule batteriche lascino il sistema di reazione, trascinate dall'effluente. Questo scopo può essere raggiunto immobilizzando la biomassa su di un supporto solido che non venga rimosso dalla corrente in uscita dal reattore. Quando una popolazione microbica è presente in un medium liquido sotto forma di singole cellule disperse, il suo comportamento fisico è governato dalle proprietà della massa liquida, quindi le cellule si comportano come elementi del fluido entro cui sono sospese e, qualora siano necessario rimuovere i liquidi di processo dal reattore, anche una parte dellapopolazione microbica complessiva verrebbe con essi eliminata. Ciò rappresenta un grande limite per il funzionamento del processo, dal momento che le cellule potrebbero essere riutilizzate in cicli successivi sia batch che continui.

cellule è un sistema che consente di stabilizzare gran parte dei microrganismi in una ben definita regione dello spazio all'interno del bioreattore, in modo che essi acquisiscano un comportamento indipendente da quello del liquido circostante. L'utilizzo dei supporti determina una maggiore attività metabolica ed una maggiore concentrazione microbica, dal momento che su di essi vengono adsorbiti i nutrienti; quindi la concentrazione dei nutrienti stessi su di una superficie può essere molto più elevata di quanto non lo sia in una soluzione acquosa. I microrganismi colonizzano le superfici costituendo i biofilm che sono formati da microcolonie di cellule batteriche, racchiuse in una matrice di polisaccaridi, secreti dalle cellule stesse, che permettono l'adesione alla superficie.

Una posizione particolare è occupata dai cellulari, secondo i quali una membrana separa, all'interno del sistema, le cellule dal terreno. Quindi,

coltura;La presenza del supporto può limitare la diffusione dei nutrienti e degli ossigeno alle cellule, riducendo la loro crescita e produttività;La rimozione dei metaboliti prodotti può essere più complessa rispetto a sistemi di coltura libera;La preparazione del supporto e l'immobilizzazione delle cellule possono richiedere tempo e risorse aggiuntive.coltura e ciò rende più complesso il recupero del prodotto di interesse dal terreno. PER L'IMMOBILIZZAZIONE DI TECNICHE CELLULE MICROBICHE Le procedure di immobilizzazione delle cellule microbiche possono essere suddivise in due classi principali: basate su metodi fisici; basate su meccanismi chimici. Le procedure basate su metodi fisici sono meno invasive di quelle chimiche e vengono, quindi, preferite per immobilizzare le cellule microbiche. Nell'immobilizzazione ottenuta con metodi fisici non si ha formazione di legame chimico, di tipo covalente, tra cellula e matrice solida. *IMMOBILIZZAZIONE PASSIVA L'adesione o adsorbimento è un tipo di immobilizzazione passiva basata sulla capacità innata di molti microrganismi di aderire spontaneamente a diverse superfici. Tale caratteristica rende questa tecnica particolarmente semplice ed economica, in quanto non necessita della presenza di un operatore che segua il processo. Talvoltaperò è richiesta l'aggiunta di particolari sostanze chimiche che favoriscano l'immobilizzazione cellulare. Il processo è estremamente semplice in quanto basta inviare una sospensione cellulare (inoculo) all'interno del reattore, preventivamente riempito con il materiale di supporto, perché le cellule aderiscano spontaneamente alla superficie di quest'ultimo. Per la semplicità della sua realizzazione questa tecnica di immobilizzazione è stata la prima ad essere usata, in particolare per la produzione dell'aceto, dove i batteri sono immobilizzati su trucioli di legno. Anche l'aggregazione è un sistema di immobilizzazione passivo ed è basato sulla naturale tendenza di alcuni tipi di cellule microbiche ad aggregarsi in alcune fasi del loro ciclo vitale fino a formare fiocchi di dimensioni tali da poter essere separati dal mezzo di reazione per semplice decantazione (cioè questi fiocchi tendono a sedimentare sul fondo del reattore).decaderesul fondo per la forza di gravità). Il fenomeno, detto flocculazione, può essere favorito chimicamente aggiungendo sostanze come silice attivata e polielettroliti. Colonizzazione Un altro tipo di immobilizzazione passiva è la colonizzazione. Questa procedura sfrutta il principio di immobilizzazione come conseguenza dello sviluppo microbico su un supporto solido, poroso, in cui risultano coinvolti meccanismi non del tutto chiariti. Questo processo è di tipo passivo e la densità cellulare dipende dal tipo di supporto. Frequentemente la selezione del supporto avviene per tentativi. Si possono usare supporti in plastica, in poliuretano, in acciaio ecc. I supporti ad alta porosità possono essere completamente riempiti, in conseguenza di un abbondante sviluppo microbico. IMMOBILIZZAZIONE ATTIVA Un tipo di immobilizzazione attiva più usata per le cellule microbiche è l'intrappolamento in matrici polimeriche. In questo caso le cellule microbiche sonomiscelate con l'agente immobilizzante prima che avvenga la polimerizzazione (cioè l'agente è prima liquido e dopo diventa solido; è quando l'agente si trova nella fase liquida che vengono aggiunte le cellule microbiche). In tale ambito sono stati valutati polimeri sintetici come il gel di poliacrilammide, le resine epossidiche, il poliestere, il poliuretano ecc; ma sono state considerati anche polimeri naturali come l'agar, l'alginato, il collagene, la gelatina, il k-carragenano ecc. Con il termine alginato si fa riferimento ai Sali dell'acido alginico, che è estratto da alghe marine, ma è anche prodotto da batteri. L'acido alginico è un copolimero (molecola contenente due o più unità monomeriche che si ripetono) composto da unità di acido-beta-mannuronico legate con legami covalenti 1,4 a residui di acido-alpha-L-glucuronico. Esistono diversi Sali dell'acido alginico: alginato di sodio,

alginato dicalcio e così via. Il sale sodico dell'acido alginico è solubile in acqua e polimerizza per gelificazione ionotropica in presenza di cationi multivalenti. L'alginato di calcio tende a formare delle sferette in soluzione acquosa.

Il carragenano è formato da unità di beta-D-galattosio e 3,6-anidro-alpha-D-galattosio. Gelifica a temperatura ambiente a formare un blocco di gel o delle sferette.

L'agarosio, invece, è costituito da unità di beta-D-galattosio e 3,6-anidro-alpha-L-galattosio.

Nell'intrappolamento le cellule sono confinate all'interno di un polimero. I pori del gel hanno dimensioni tali da consentire la diffusione del substrato e del prodotto, ma non la fuoriuscita delle cellule. Il gel che viene a formarsi consente ancora alle cellule di svilupparsi e riprodursi, ma si sfalda se la quantità di biomassa in esso contenuta diventa superiore al 30%. Bisogna ricordare che in questo caso non si formano

legame tra matrice e cellule e si hanno così contenuti rischi di danneggiamento dell'attività e della vitalità cellulare. Questo tipo di immobilizzazione cellulare viene utilizzata, ad esempio, per la produzione di spumanti. Queste bevande vengono preparate con diverse fasi. All'inizio vengono assemblati vari tipi di vini provenienti da vitigni (una particolare vite usata generalmente per produrre vini) e vigneti (appezzamenti di terreno su cui si coltivano i vitigni). Si ottiene così il vino base. Al vino di base (cuvée) viene aggiunto uno sciroppo zuccherino chiamato liqueur de tirage composto da lieviti selezionati (e immobilizzati in una soluzione di alginato di calcio), zucchero di canna e sostanze azotate nutritive; quindi il vino viene imbottigliato con normali tappi a corona. Le bottiglie vengono accatastate in posizione orizzontale, in luoghi freschi e bui, dove avviene la seconda fermentazione, che dura diversi mesi.

fase i lieviti tra-sformano gli zuccheri in alcol e anidride carbonica, aumenta quindi la presenza di alcole nella bottiglia si forma una pressione di 6-7 atm. Consumati gli elementi nutritivi, ilieviti muoiono e le loro cellule si depositano nella bottiglia, il contatto con questi ele -menti fa sì che nel vino si sviluppino gli aromi tìpici di questi prodotti. Questocontatto dura non meno di 1-2 anni. Durante questo periodo l’unica operazione svoltaè lo sbancamento: circa ogni 6 mesi le cataste vengono smontate e rimontate,scuotendo le bottiglie per rimettere in sospensione il deposito affinché non aderiscatroppo al vetro e avvenga un contatto maggiore tra vino e lieviti. Concluso il lungoperiodo di maturazione, all’interno delle bottiglie si è formato un deposito compatto,composto principalmente da cellule di lieviti, disposto lungo la parete della botti glia eche deve essere eliminato. Le bottiglie vengono dunque trasferite dalle

cataste,nelle pupitre dei supporti di legno a cavalletto con appositi fori, con il collo verso il basso. PUPITRE

In questa posizione, degli uomini imprimono giorno dopo giorno degli scuotimenti.Questa fase non è necessaria nel caso in cui vengano impiegati lieviti immoblizzati.

Terminato lo scuotimento, le bottiglie vengono tolte dalle pupitre e conservate con il tappo verso il basso. In questo momento i sedimenti sono tutti vicini al tappo, dentro la capsula (che è stata aggiunta sotto il tappo a corona durante l'imbottigliamento); per eliminarli senza perdere troppa pressione e vino, si ghiaccia il collo delle bottiglie facendolo passare in un liquido refrigerante a -25 °C: all'interno si forma un piccolo ghiacciolo che intrappola le fecce (deposito di lieviti). A questo punto la bottiglia viene stappata da apposite macchine, e la pressione interna espelle il ghiacciolo. Insieme al ghiacciolo esce anche del vino, e le bottiglie

vengono,immedia