11 tipi di colture e fermentatori + parametri di fermentazione + sistemi di agitazione e aerazione

CLASSIFICAZIONE DELLE COLTURE

Le colture microbiche possono essere distinte innanzitutto in base alla consistenza del

colture solide colture

terreno di coltura utilizzato. Si può, infatti, parlare di e

in liquido.

*COLTURA SOLIDA

La coltura solida è ampiamente diffusa a livello laboratoriale, sia in provetta, sia in

piastra e il termine “solida” identifica l’impiego di terreno colturale addizionato di agar.

Anche in ambito industriale si ha questo tipo di coltura, ma in questo caso non si usa

l’agar per rendere solido il terreno dal momento che questo polisaccaride risulta

essere abbastanza costoso. A livello industriale si usano terreni come residui ligno-

cellulosici che sono già di per sé solidi.

*COLTURA LIQUIDA

In generale, in ambito industriale si preferisce ricorrere all’uso di colture in liquido (sia

per processi aerobi che per quelli anaerobi), che prevedono, cioè, l’uso di terreni

liquidi. Quando si ricorre all’utilizzo di un terreno liquido, la coltura può essere

sommersa , termine che identifica un processo condotto in condizioni di agitazione

e aerazione e viene impiegata per processi aerobi. In laboratorio, per allestire una

coltura di questo tipo si usano delle beute che, dopo inoculo, sono poste a incubare su

agitatori alternativi o rotativi. Per volumi superiori a 0,5-1L le colture sono allestite in

fermentatore dotato di sistema di aerazione e, generalmente, di agitazione.

condizioni stazionarie,

La coltura liquida viene impiegata anche in sia per

microrganismi anaerobi che per microrganismi aerobi. La coltura liquida stazionaria è

allestita sia in ambito laboratoriale (in provette o beute) e sia in ambito industriale (in

fermentatori). Ovviamente la beuta non viene connessa ad agitatori e anche nel

fermentatore manca l’agitazione, trattandosi di coltura stazionaria. Questo tipo di

in alto strato

coltura può essere (cioè il recipiente, beuta o fermentatore, viene

riempito per quasi tutto il suo volume; questo tipo di coltura viene condotta in

in basso strato

anaerobiosi); o può essere (cioè la beuta o il fermentatore viene

riempita con un volume minimo di coltura microbica, in modo da favorire l’aerazione;

questo tipo di coltura viene condotta, quindi, in aerobiosi). A livello di larga scala si

impiegano vassoi che possono avere anche grosse dimensioni (1 x 2 m), contenenti

terreno in basso strato (15-25 cm di terreno). Nel caso di colture stazionarie in basso

strato avverrà lo sviluppo delle cellule microbiche solo in superficie. Pertanto si può

colture superficiali.

parlare anche di

Le colture possono essere distinte anche in base alla modalità con cui viene fornito il

nutrimento alle cellule. In questo caso si distinguono:

colture in batch

Le . La coltura in batch è un sistema chiuso, in quanto

 all’inizio della coltura vengono forniti tutti i nutrienti necessari alla crescita

cellulare (detti nel loro complesso terreno di coltura) senza aggiunte successive.

La cinetica di crescita è caratterizzata da quattro fasi: fase di latenza, durante la

quale le cellule si adattano al terreno, perciò non si ha un incremento della

biomassa (massa complessiva delle cellule); fase di crescita esponenziale, nella

quale le cellule si dividono molto rapidamente, secondo appunto un andamento

x

esponenziale del tipo y= 2 , dove y è il numero di cellule e x il numero di

generazioni; fase stazionaria, durante la quale la crescita rallenta man mano

che i nutrienti scarseggiano, fino ad arrestarsi; fase di letalità, nella quale la

scarsità di nutrienti è tale da causare la diminuzione della biomassa, poiché

muoiono più cellule di quelle che si generano, determinando la fine della

coltura. In questo tipo di coltura, quando lo sviluppo cessa, il terreno colturale

viene raccolto e trattato per il recupero del prodotto fermentativo. E' il sistema

usato per produrre antibiotici, aminoacidi, enzimi e altri prodotti.

colture in batch con riciclo di biomassa.

Le In questo caso si

 recupera la biomassa separandola dal prodotto. La biomassa verrà usata per

una successiva coltura in batch. In questo modo si avrà un aumento di

biomassa nella seconda coltura in batch rispetto alla prima e si avrà, di

conseguenza, anche un incremento nella produzione di metabolita.

colture in continuo.

Le La coltura in continuo è invece un sistema

 aperto, in cui nuovo terreno di coltura è immesso costantemente, mentre quello

che si è esaurito è eliminato, generalmente attraverso due pompe. Dato che si

ha una continua immissione di substrato e un continuo prelievo di prodotto, il

volume rimane costante e si genera una condizione di steady state (stato

stazionario). Prevede tre fasi: la prima è una fase in batch, con entrambe le

pompe non funzionanti, necessaria per raggiungere un’adeguata biomassa. Al

termine della crescita esponenziale, comincia la fase di start-up, in cui le

cellule vengono alimentate e si assiste ad un ulteriore aumento della biomassa.

L’ultima è invece la fase stazionaria, nella quale la biomassa resta costante e i

flussi in entrata e in uscita non cambiano. Lo svantaggio principale di questo

tipo di coltura è la delicatezza del sistema, visto che la media-lunga durata del

processo può portare a contaminazione, così come le numerose e ripetute

divisioni cellulari possono portare all’accumulo di mutazioni nelle cellule, fattore

non irrilevante trattandosi di organismi selezionati. Rispetto alle colture in

batch, le colture in continuo non prevedono tempi morti (quali svuotamento del

fermentatore, pulizia del fermentatore e sterilizzazione dello stesso e

riempimento del fermentatore). Le colture in continuo sono meno costose dal

momento che richiedono meno personale perché le colture così allestite

vengono controllate da sistemi computerizzati. Le colture in continuo vengono

utilizzate per la produzione di aceto, etanolo, birra, per il trattamento dei rifiuti

ecc.

colture in fed batch.

Le Si tratta di un sistema semi-aperto, in quanto è

 aperto solo in entrata, ma non in uscita, perciò è anche detto a volume

variabile. Il terreno fresco viene aggiunto fino a quando non si raggiunge un

volume prestabilito. Anche questo tipo di coltura è diviso in più fasi: inizialmente

si ha una fase in batch, poi, una volta raggiunta un’adeguata biomassa, inizia il

processo fed-batch. La biomassa aumenta in proporzione ai nutrienti forniti, fino

a che non sono altri fattori a causare un rallentamento della crescita, come ad

esempio la scarsità di ossigeno; a questo punto è conveniente rallentare il

flusso di nutriente fino ad arrestare il sistema. La coltura in fed-batch, sebbene

di breve durata (alcune decine di ore), previene problemi di inibizione da

prodotti del metabolismo cellulare tossici e l’accumulo di mutazioni, oltre a

diminuire la possibilità di contaminazione; inoltre, consente di recuperare la

biomassa per iniziare un nuovo processo. Con la fed-batch si producono lieviti

per la panificazione, penicillina G, cefalosporine, amminoacidi ecc. Tutti questi

prodotti vengono sintetizzati dai microrganismi durante la biofase (o fase

stazionaria). E’ quindi importante mantenere la coltura cellulare in questa fase

con una continua addizione di nutrienti.

colture extende batch

Le . Si tratta di colture in cui si aggiunge terreno

 di coltura sterile e si toglie lo stesso volume di brodo colturale a intervalli di

tempo prefissati.

Quando possibile sarebbe più vantaggioso operare con processi continui perché

presentano costi di produzione minori a seguito della riduzione dei tempi morti. La

coltura batch presenta, infatti, tempi morti, in cui non si ha formazione di prodotto e

consumo di substrato. I sistemi in continuo, inoltre, forniscono una maggiore

produttività, una migliore adattabilità ai sistemi di controllo e infine prevedono