11 tipi di colture e fermentatori + parametri di fermentazione + sistemi di agitazione e aerazione

Classificazione delle colture

Colture solide e liquide

Le colture microbiche possono essere distinte innanzitutto in base alla consistenza del terreno di coltura utilizzato. Si può, infatti, parlare di colture solide e colture liquide.

Coltura solida

La coltura solida è ampiamente diffusa a livello laboratoriale, sia in provetta, sia in piastra, e il termine "solida" identifica l’impiego di terreno colturale addizionato di agar. Anche in ambito industriale si ha questo tipo di coltura, ma in questo caso non si usa l’agar per rendere solido il terreno dal momento che questo polisaccaride risulta essere abbastanza costoso. A livello industriale si usano terreni come residui ligno-cellulosici che sono già di per sé solidi.

Coltura liquida

In generale, in ambito industriale si preferisce ricorrere all’uso di colture in liquido (sia per processi aerobi che per quelli anaerobi), che prevedono, cioè, l’uso di terreni liquidi. Quando si ricorre all’utilizzo di un terreno liquido, la coltura può essere sommersa, termine che identifica un processo condotto in condizioni di agitazione e aerazione e viene impiegata per processi aerobi. In laboratorio, per allestire una coltura di questo tipo si usano delle beute che, dopo inoculo, sono poste a incubare su agitatori alternativi o rotativi.

Per volumi superiori a 0,5-1L le colture sono allestite in fermentatore dotato di sistema di aerazione e, generalmente, di agitazione. La coltura liquida viene impiegata anche in condizioni stazionarie, sia per microrganismi anaerobi che per microrganismi aerobi. La coltura liquida stazionaria è allestita sia in ambito laboratoriale (in provette o beute) e sia in ambito industriale (in fermentatori).

Ovviamente la beuta non viene connessa ad agitatori e anche nel fermentatore manca l’agitazione, trattandosi di coltura stazionaria. Questo tipo di coltura può essere in alto strato (cioè il recipiente, beuta o fermentatore, viene riempito per quasi tutto il suo volume; questo tipo di coltura viene condotta in anaerobiosi) o può essere in basso strato (cioè la beuta o il fermentatore viene riempito con un volume minimo di coltura microbica, in modo da favorire l’aerazione; questo tipo di coltura viene condotta, quindi, in aerobiosi). A livello di larga scala si impiegano vassoi che possono avere anche grosse dimensioni (1 x 2 m), contenenti terreno in basso strato (15-25 cm di terreno). Nel caso di colture stazionarie in basso strato avverrà lo sviluppo delle cellule microbiche solo in superficie. Pertanto si può parlare anche di colture superficiali.

Modalità di nutrimento

Le colture possono essere distinte anche in base alla modalità con cui viene fornito il nutrimento alle cellule. In questo caso si distinguono:

• Colture in batch. La coltura in batch è un sistema chiuso, in quanto all'inizio della coltura vengono forniti tutti i nutrienti necessari alla crescita cellulare (detti nel loro complesso terreno di coltura) senza aggiunte successive. La cinetica di crescita è caratterizzata da quattro fasi: fase di latenza, durante la quale le cellule si adattano al terreno, perciò non si ha un incremento della biomassa (massa complessiva delle cellule); fase di crescita esponenziale, nella quale le cellule si dividono molto rapidamente, secondo appunto un andamento esponenziale del tipo y = 2^x, dove y è il numero di cellule e x il numero di generazioni; fase stazionaria, durante la quale la crescita rallenta man mano che i nutrienti scarseggiano, fino ad arrestarsi; fase di letalità, nella quale la scarsità di nutrienti è tale da causare la diminuzione della biomassa, poiché muoiono più cellule di quelle che si generano, determinando la fine della coltura. In questo tipo di coltura, quando lo sviluppo cessa, il terreno colturale viene raccolto e trattato per il recupero del prodotto fermentativo. È il sistema usato per produrre antibiotici, aminoacidi, enzimi e altri prodotti.
• Colture in batch con riciclo di biomassa. In questo caso si recupera la biomassa separandola dal prodotto. La biomassa verrà usata per una successiva coltura in batch. In questo modo si avrà un aumento di biomassa nella seconda coltura in batch rispetto alla prima e si avrà, di conseguenza, anche un incremento nella produzione di metabolita.
• Colture in continuo. La coltura in continuo è invece un sistema aperto, in cui nuovo terreno di coltura è immesso costantemente, mentre quello che si è esaurito è eliminato, generalmente attraverso due pompe. Dato che si ha una continua immissione di substrato e un continuo prelievo di prodotto, il volume rimane costante e si genera una condizione di steady state (stato stazionario). Prevede tre fasi: la prima è una fase in batch, con entrambe le pompe non funzionanti, necessaria per raggiungere un’adeguata biomassa. Al termine della crescita esponenziale, comincia la fase di start-up, in cui le cellule vengono alimentate e si assiste ad un ulteriore aumento della biomassa. L’ultima è invece la fase stazionaria, nella quale la biomassa resta costante e i flussi in entrata e in uscita non cambiano. Lo svantaggio principale di questo tipo di coltura è la delicatezza del sistema, visto che la media-lunga durata del processo può portare a contaminazione, così come le numerose e ripetute divisioni cellulari possono portare all’accumulo di mutazioni nelle cellule, fattore non irrilevante trattandosi di organismi selezionati. Rispetto alle colture in batch, le colture in continuo non prevedono tempi morti (quali svuotamento del fermentatore, pulizia del fermentatore e sterilizzazione dello stesso e riempimento del fermentatore). Le colture in continuo sono meno costose dal momento che richiedono meno personale perché le colture così allestite vengono controllate da sistemi computerizzati. Le colture in continuo vengono utilizzate per la produzione di aceto, etanolo, birra, per il trattamento dei rifiuti ecc.
• Colture in fed batch. Si tratta di un sistema semi-aperto, in quanto è aperto solo in entrata, ma non in uscita, perciò è anche detto a volume variabile. Il terreno fresco viene aggiunto fino a quando non si raggiunge un volume prestabilito. Anche questo tipo di coltura è diviso in più fasi: inizialmente si ha una fase in batch, poi, una volta raggiunta un’adeguata biomassa, inizia il processo fed-batch. La biomassa aumenta in proporzione ai nutrienti forniti, fino a che non sono altri fattori a causare un rallentamento della crescita, come ad esempio la scarsità di ossigeno; a questo punto è conveniente rallentare il flusso di nutriente fino ad arrestare il sistema. La coltura in fed-batch, sebbene di breve durata (alcune decine di ore), previene problemi di inibizione da prodotti del metabolismo cellulare tossici e l’accumulo di mutazioni, oltre a diminuire la possibilità di contaminazione; inoltre, consente di recuperare la biomassa per iniziare un nuovo processo. Con la fed-batch si producono lieviti per la panificazione, penicillina G, cefalosporine, amminoacidi ecc. Tutti questi prodotti vengono sintetizzati dai microrganismi durante la biofase (o fase stazionaria). È quindi importante mantenere la coltura cellulare in questa fase con una continua addizione di nutrienti.
• Colture extended batch. Si tratta di colture in cui si aggiunge terreno di coltura sterile e si toglie lo stesso volume di brodo colturale a intervalli di tempo prefissati.

Quando possibile sarebbe più vantaggioso operare con processi continui perché presentano costi di produzione minori a seguito della riduzione dei tempi morti. La coltura batch presenta, infatti, tempi morti, in cui non si ha formazione di prodotto e consumo di substrato. I sistemi in continuo, inoltre, forniscono una maggiore produttività, una migliore adattabilità ai sistemi di controllo e infine prevedono.