11 tipi di colture e fermentatori + parametri di fermentazione + sistemi di agitazione e aerazione

Processi con l'impiego dei microrganismi in bioreattore o fermentatore

I processi che prevedono l'impiego dei microrganismi vengono comunemente condotti in un bioreattore o fermentatore. I termini "fermentatore da laboratorio" e "bioreattore" vengono utilizzati in maniera intercambiabile, come sinonimi. Tuttavia si parla più spesso di fermentatori per le colture microbiche e di bioreattori per le colture cellulari.

Un bioreattore è un reattore cilindrico munito di un certo numero di entrate e uscite provviste di valvole. Il volume utile, cioè quello che viene riempito con la coltura, è circa 2/3 della capacità totale; lo spazio non occupato costituisce la testa, detta anche cupola.

I processi in condizioni di anaerobiosi vengono allestiti in fermentatori privi dei sistemi di aerazione e di agitazione. I processi aerobi, in cui è fondamentale il trasferimento di massa (ossigeno) dalla fase gassosa (aria; esterno del fermentatore) alla fase liquida (brodo coltura; interno del fermentatore), prevedono l'impiego di...

fermentatori generalmente dotati sia di sistemi di aerazione, cioè sparger tube immissione di aria tramite un dispositivo di distribuzione ( ), sia sistemi di agitazione, in grado di creare alte superfici di scambio gas-liquidi.

L'agitazione può essere creata in modo meccanico oppure tramite l'aria. L'agitazione ha anche la funzione di rendere omogeneo il sistema evitando la formazione di zone a elevata ossigenazione, rispetto ad altre in difetto o a differente concentrazione di cellule o di metaboliti.

Il fermentatore presta, in particolare modo sulla testata, delle entrate e uscite che possono servire per addizioni di precursori, di agenti per il controllo del pH e della formazione di schiuma. In testata si trova, inoltre, l'uscita dei gas, generalmente provvista di sistema di refrigerazione, per mantenere costante il volume della brodocoltura. Il fermentatore è inoltre dotato di un dispositivo, protetto da valvola, per i prelievi di brodocoltura.

Eventualmente necessari nel corso del processo. In relazione alla dimensione del fermentatore, il punto di prelievo può essere diversamente posizionato, generalmente nei fermentatori di grosse dimensioni è nella parte bassa. Al fermentatore sono connesse una serie di sonde:

• Una sonda, connessa a un termometro che controlla la temperatura. Se è necessario abbassare la temperatura viene immesso un liquido freddo nella camicia del fermentator; al contrario, se è necessario aumentare la temperatura, viene immesso un liquido caldo nella camicia del fermentatore.
• Nel caso più semplice di processo in beuta è opportuno termoregolare l'ambiente (cella termostatica) che contiene le beute poste a incubare. Quando si opera con piccoli fermentatori (fino a 20 L) può essere conveniente immergerli in vasche opportunamente termostatate.
• Una sonda, connessa a un pHmetro, che controlla il pH. Se il pH è basso si aggiunge una soluzione basica; al contrario,

se il pH è alto si aggiunge una soluzione acida. Una sonda che controlla il valore di ossigeno disciolto: se la coltura è aerobia, questo valore non può scendere al di sotto del 5% di concentrazione. La coltura viene iniziata a bassi livelli di ossigeno che poi verrà innalzata mano a mano che l'ossigeno viene consumato e che il numero di cellule aumenta.

Una sonda che rileva il livello di liquido o la presenza di schiuma. Se il livello di schiuma è alto si aggiunge una soluzione anti-schiuma. Gli antischiuma possono essere efficienti (come quelli siliconici) o un po' meno (come gli oli). Diversi sistemi di tipo meccanico sono stati proposti come alternativa all'impiego di agenti antischiuma. I dispositivi più impiegati si basano per lo più sull'azione di giranti o turbine, collocate in cupola del fermentatore, che centrifugano la schiuma, con velocità che può essere dipendente o indipendente da quella dell'agitatore.

La schiuma, che può essere prodotta a causa dell'agitazione, se non controllata, può rappresentare un problema molto importante. I parametri relativi a un processo fermentativo condotto in bioreattori, quali pH, temperatura, concentrazione di ossigeno ecc., come detto, possono essere rilevati da sonde connesse al fermentatore (e, quindi, si dice che sono rilevati on line, cioè in tempo reale) oppure possono essere calcolati a partire da un campione prelevato dal fermentatore per mezzo dell'apertura posta solitamente in basso, di lato al fermentatore. In quest'ultimo caso si dice che i parametri sono rilevati off line. Tra i parametri misurati on line rientrano i seguenti: - Temperatura; - Agitazione; - Pressione; - Flusso dell'aria (o di altri gas); - Ossigeno disciolto; - pH; - Velocità e quantità di acidi o basi aggiunti; - Velocità e quantità di nutrienti aggiunti; - Rilevazione e controllo della schiuma.parametri rilevati off line rientrano i seguenti:

• Zuccheri
• Proteine
• Livelli di azoto
• Attività enzimatica
• ATP e NADH
• Prodotti finali
• Biomassa (peso secco, densità ottica)
• Conta vitale
• Conta totale

I parametri vengono misurati on line tramite delle sonde che rilevano un determinato parametro, ad esempio la temperatura, e forniscono un segnale che viene amplificato da un condizionatore di segnale. Interviene, quindi, un regolatore, ad esempio nel caso della temperatura interviene una valvola che fa fuoriuscire l'acqua (fredda o calda a seconda delle temperatura). Il regolatore agisce dipendentemente dal segnale derivato dal condizionatore del segnale. Il valore misurato è automaticamente confrontato con quello impostato (set point) e da questo segnale scaturisce il segnale di regolazione. La regolazione può essere effettuata in diversi modi:

• Regolazione discontinua: in questo tipo di regolazione il regolatore fa interventi momentanei,

Cioè agisce solo quando la variabile si discosta dal valore impostato. In questo modo il valore della variabile oscilla nell'ambito del set point tra un massimo e un minimo.

Regolazione continua

Un importante parametro da controllare e regolare è la concentrazione di ossigeno, la quale viene regolata con un meccanismo a cascata. All'inizio di ogni processo la biomassa è molto poca e quindi si richiede poco ossigeno disciolto e una bassa agitazione. All'aumentare della biomassa deve crescere anche la quantità di ossigeno disciolta e l'agitazione in modo da favorire la solubilità dell'ossigeno, la concentrazione di ossigeno non deve mai scendere al di sotto di una valore percentuale pari al 5%. La concentrazione di ossigeno può essere valutata con la stessa sonda che viene utilizzata per la quantificazione del glucosio. Questo sensore è basato sull'impiego dell'enzima glucosio ossidasi (GOD), che catalizza la

reazione di trasformazione del glucosio in acido gluconico (che deve essere rimosso):
glucosio + O2 + H2O → acido gluconico + H2O
Dato che in questa reazione si consuma una molecola di ossigeno per ogni molecola di acido gluconico formata, la quantità di acido gluconico è direttamente proporzionale alla quantità di ossigeno presente nel fermentatore. In base alla concentrazione rilevata, il regolatore agisce aumentando l'agitazione e l'immissione (o riducendo entrambe).

Un più recente sistema di controllo delle variabili è il sistema di controllo PID. L'acronimo PID deriva dalle tre azioni svolte da questi dispositivi che sono rispettivamente azione Proporzionale, azione Integrale e azione Derivata. Nel sistema PID il controllore viene posto in serie con il sistema da controllare. Una sonda misura una variabile fornendo un segnale in uscita y(t). Questo segnale viene confrontato con il valore di riferimento r(t). Il valore della variabile

che è stato misurato e il valore di riferimento sono differenti. La differenza tra i due è detta errore e(t). In base a questo errore, il regolatore esercita una determinata azione di controllo u(t) sul sistema. Quando parliamo di azione proporzionale significa che l'ingresso e(t) e l'uscita u(t) sono legati algebricamente da un coefficiente KP, detto anche coefficiente dell'azione proporzionale, o semplicemente guadagno proporzionale. Il significato dell'azione proporzionale sta nel fatto che maggiore sarà l'errore e(t) all'ingresso del controllore e maggiore sarà l'azione di controllo svolta dallo stesso regolatore. Quando parliamo di azione integrale significa che l'azione è proporzionale all'integrale dell'errore rispetto al tempo. L'azione derivativa dipende dalla velocità con cui varia l'errore. CHEMOSTATO: il fermentatore per le colture continue Se nel sistema di coltivazione cicoltura rimanga costante nel tempo. In questo modo, le cellule possono crescere in modo continuo, senza raggiungere la fase stazionaria. Il chemostato è un dispositivo molto utile per studiare il comportamento dei batteri in condizioni di crescita continua. Permette di mantenere costanti le condizioni di coltura e di monitorare l'andamento della crescita nel tempo. Inoltre, il chemostato consente di ottenere una produzione continua di prodotti metabolici da parte dei batteri. Questo è particolarmente vantaggioso in ambito industriale, dove la produzione continua è spesso preferibile alla produzione batch. In conclusione, il chemostato è uno strumento fondamentale per lo studio e l'ottimizzazione dei processi di crescita batterica in condizioni di crescita continua.coltura rimanga costante. A flusso=0, il chemostato equivale a una coltura inbatch, e la biomassa (numero di cellule) sarà quella massima consentita dal nutrienteaggiunto all'inizio.
Dividendo il flusso F per il volume della coltura presente nella camera di crescita,otteniamo la velocità di diluizione: D=F/V
Il numero dei microrganismi (biomassa) presente nella camera di coltura dipende dai microrganismi che si riproducono e da quelli che abbandonano il chemostato: biomassa= microrganismi che crescono – microrganismi chefuoriescono
I microrganismi che crescono possono essere espressi come il prodotto tra la velocità di crescita μ (che dipende dal flusso di terreno fresco che viene immesso nel chemostato) e la biomassa X (numero di microrganismi presenti nel chemostato): Microrganismi che crescono= μX