1.Generalita' dei lieviti, lieviti killer, condizioni di crescita

Il citoplasma di questi organismi unicellulari ha un pH pari a 5.0.

I ribosomi sono costituiti, come per tutti gli eucarioti, da una subunità maggiore con coefficiente di sedimentazione di 60 S e da una subunità minore con coefficiente di sedimentazione di 40 S. Il ribosoma dei lieviti (ma in generale degli eucarioti) ha un coefficiente totale di sedimentazione pari a 80 S. Ricorda che il coefficiente di sedimentazione di un ribosoma costituito da entrambe le subunità non è pari alla somma dei coefficienti di sedimentazione di ciascuna subunità quando sono separate. Questo dipende dal fatto che il coefficiente di sedimentazione è un parametro che fa riferimento alla velocità con cui una macromolecola, in questo caso un ribosoma o le singole subunità ribosomiali, sedimentano (cioè, cadono sul fondo) in un recipiente riempito con una soluzione liquida. Il tempo impiegato per sedimentare dipende molto dalla forma della macromolecola.

la quale forma è abbastanza differente tra un ribosoma intero e le singole subunità. Ogni subunità ribosomiale si compone di rRNA e di proteine ribosomiali. Gli rRNA sono ripartiti come nella figura che segue:

Ribosoma eucariotico

Sub. maggiore

Sub. minore

Altri organuli presenti nel citoplasma dei lieviti sono:

• Gli sferosomi (o globuli lipidici): sono organuli di forma sferica all'interno dei quali avviene la sintesi e l'accumulo dei lipidi;
• I perossisomi: sono organelli cellulari presenti in tutte le cellule eucariote, all'interno dei quali avviene lo smaltimento delle tossine, l'accorciamento degli acidi grassi a catena lunga (che poi verranno completamente ossidati nei mitocondri), l'ossidazione di aminoacidi e acido urico ecc.;
• I proteasomi: corpuscoli con attività proteolitica;
• L'Apparato del Golgi: è un sistema costituito da tante membrane chiuse che formano cisterne, le quali sono impilate l'una

sull'altra assumendo una forma leggermente concava da un lato e convessa dall'altro. Al suo interno si svolgono maturazione e smistamento delle biomolecole necessarie alle funzioni cellulari, tra cui le proteine neosintetizzate, i lipidi di membrana ecc. L'apparato di Golgi può trovarsi approssimato al reticolo endoplasmatico o disperso nel citoplasma. In un apparato di Golgi si può distinguere una faccia cis, cioè quella rivolta verso il reticolo endoplasmatico e una faccia trans, cioè quella rivolta verso il citoplasma. Ai margini laterali delle cisterne sono spesso visibili piccole vescicole che si formano per gemmazione, ossia estroflessioni della membrana, che si distaccano da una cisterna e si fondono sulla membrana della cisterna successiva. Nelle cisterne ci sono diversi enzimi che provvedono a modificare le molecole che vengono trasportate dalle vescicole che, fondendosi con le membrane, riversa queste molecole nelle cisterne stesse. In ogni

Cisterna avviene, quindi, un determinato passaggio dell'amaturazione delle biomolecole.

I mitocondri.

Come in tutti gli eucarioti, anche nel citoplasma dei lieviti è presente il nucleo. La forma del nucleo è dovuta alla presenza di una "impalcatura" all'interno del nucleo stesso, la quale impalcatura è più specificamente chiamata nucleoscheletro. Il nucleoscheletro si compone di due elementi principali: la lamina nucleare e la rete fibrillare. La lamina nucleare è un intreccio di filamenti intermedi. I filamenti intermedi sono costituiti da monomeri polipeptidici lineari, dotati di una testa aminoterminale, un dominio a bacchetta ad alpha-elica e una coda carbossiterminale. I monomeri polimerizzano in dimeri coleid-coil paralleli, i quali si accoppiano in modo antiparallelo e sfalsato in tetrameri.

La rete fibrillare è un intreccio lasso di fibre proteiche. La lamina nucleare si dispone perimetralmente alla faccia interna.

della membrana nucleare, mentre la rete fibrillare occupa tutto lo spazio del nucleoplasma non occupato dall'acromatina. Il comparto interno del nucleo è occupato prevalentemente dalla cromatina (insieme di DNA e proteine istoniche). Durante le fasi di divisione cellulare, la cromatina si condensa a formare i cromosomi. Nei lieviti, ad esempio nel lievito Saccharomyces Cerevisiae, che è il lievito per eccellenza, si contano da 2 a 16 cromosomi. In alcuni lieviti, come in S.cerevisiae, Candida, Pichia Pastoris ecc., si presentano anche plasmidi o materiale genetico virale che producono una tossina, chiamata fattore killer. Queste proteine sono secrete nel mezzo e si chiamano killer perché uccidono cellule di lievito differenti. I ceppi che producono la tossina, producono anche un fattore di immunità. I lieviti sensibili muoiono in presenza di tossine killer, mentre i lieviti neutri non le producono e non sono sensibili.

Per stabilire se un lievito produce tossine oppure no, bisogna fare un saggio microbiologico. Si usa un l'agar prima che solidifichi; dopo che la temperatura dell'agar si è abbassata (ma sempre prima che solidifichi) si inoculano i funghi (lieviti) sensibili alle tossine. Una volta solidificato l'agar, si semina il ceppo che si vuole studiare e si incuba il tutto a 20°C (perché le tossine killer funzionano a temperature di circa 20°C e a pH acido, compreso tra 4.2 e 4.7). Si fa eccezione per la tossina HM-1 di Williopsis Mrakii che è termostabile ed è attiva a pH compresi tra 2 e 11. Dopo due o tre giorni di incubazione si controllano le piastre:

• Se il ceppo di interesse produce la tossina killer, allora si vedrà attorno agli strisci in cui ho seminato degli aloni di inibizione;
• Se il ceppo di interesse non produce la tossina killer, non si vedranno aloni.

Il problema è che se non si vedono aloni non è detto che il lievito non produca tossine, potrebbe essere semplicemente insensibile alle condizioni di crescita utilizzate nel saggio.

riparo del materiale genetico dei VLP. Inoltre, ci sono anche geni che codificano perenzimi coinvolti nella sintesi delle tossine e nella loro secrezione. Le particelle virali, una volta formate nel citoplasma delle cellule produttrici, vengonosegrete all'esterno della cellula attraverso un processo di esocitosi. Una volta fuori dallacellula, le particelle virali possono infettare altre cellule di lievito e iniziare il lorociclo riproduttivo. È importante sottolineare che le particelle virali non sono in grado di infettare organismi superiori, come piante o animali, ma sono specifiche per il lievito. Pertanto, non rappresentano un pericolo per la salute umana o animale. In conclusione, il ceppo di lievito che produce la tossina è in grado di farlo grazie allapresenza delle particelle virali non infettive, che vivono in simbiosi con il lievito e cheproducono i componenti necessari per la sintesi e la secrezione della tossina.aumenta la produzione di radicali liberi.causa l'arresto del ciclocellulare in fase G2; altre tossine arrestano il ciclo cellulare in fase G1; oppure inibiscono l'attività della beta-1,3-D-glucano sintasi (enzima implicato nella sintesi della parete cellulare); altre tossine ancora possono causare la formazione dei pori al livello della membrana e vengono, così, alterati i trasporti cellulari. Quindi la cellula va incontro a morte. Un ceppo è maggiormente sensibile alla tossina quando si trova nella fase esponenziale della sua crescita (cioè quando si moltiplica). Durante questa fase il metabolismo è più veloce e, quindi, viene prodotto più ATP rispetto, ad esempio, allo stato stazionario, dove il metabolismo produce meno ATP. Dato che il trasporto della tossina dalla membrana esterna a quella interna richiede energia, e dato che durante la fase esponenziale si produce più energia, il lievito, sensibile di per sé alla tossina, risulterà maggiormente

sensibile proprio durante la fase esponenziale.Si pensava che il fattore killer fosse molto importante per la capacità di prenderepossesso e dominare un determinato ambiente. Tuttavia si è poi scoperto che gli altrifattori ambientali agiscono in modo importante sulla dominanza di un ceppo rispettoad un altro; un esempio è dato dalla capacità di gestione dell'azoto, elemento pocopresente nel mosto se paragonato agli zuccheri e quindi fattore limitante: i ceppi chemeglio riuscivano ad assimilare l'azoto, e quindi più veloci nella fermentazione, eranoagevolati rispetto a quelli più lenti esercitando un fattore di dominanza importanterispetto ad altri ceppi (anche se killer). Dal punto di vista enologico il fattore killer nonè quindi fondamentale, anche se si continuano comunque a selezionare ceppi neutri(né producono il fattore killer e né sono sensibili). In enologia, i lieviti killerappartenenti alla specie

Saccharomyces cerevisiae sono attualmente impiegati come "starter". Tuttavia il loro maggior limite consiste nel fatto che la tossina killer di S.cerevisiae non ha alcun effetto sui lieviti selvaggi. Attraverso alcuni studi è risultato che la tossina prodotta da Kluyveromyces phaffii ha un ampio spettro di attività. La tossina è risultata attiva in un intervallo di pH compreso fra 3 e 5 ed a temperature inferiori a 40°C. Tali caratteristiche potrebbero consentire l'uso della tossina prodotta da K. phaffii per la vinificazione. L'azione della tossina può essere di tipo fungistatico o fungicida in funzione della sua concentrazione. L'utilizzo di lieviti killer, unitamente a quello di lieviti sensibili, è consigliato per la produzione di vini perché la presenza della tossina causa lisi dei lieviti sensibili. Normalmente, i lieviti continuano a fermentare anche dopo l'imbottigliamento. Ad un certo punto le sostanze

nutritive terminano e i lieviti bloccano la