16 Identificazione dei lieviti in base alle caratteristiche fenotipiche (morfologia, fisiologia e aspetti microscopici)

Procedura per l'identificazione delle cellule isolate

Per identificare le cellule isolate, è necessario preparare una provetta (o più provette nel caso in cui si vogliano identificare più cellule isolate). All'interno della provetta preparata con il terreno, viene inoculata una goccia della sospensione di cellule utilizzando una pipetta Pasteur. Le provette vanno lasciate in incubazione, possibilmente con agitazione.

La positiva assimilazione della sorgente di carbonio viene dimostrata dall'intorbidimento della sospensione. Se si osserva intorbidimento entro 7 giorni, l'assimilazione si dice rapida e forte (+). Se lo sviluppo (e quindi l'intorbidimento) si verifica solo dopo 14 giorni, l'assimilazione si dice debole (w, che sta per weak). Se lo sviluppo avviene in 21 giorni, l'assimilazione si dice debole o lenta (w o s, che sta per slow). In caso di assenza di attività, si indica con il simbolo "-". Il simbolo +/- si usa quando si osserva una normale positività, ma alcuni ceppi possono presentare una debole reazione.

Della specie sono negativi; il simbolo -/+ si usa quando si osserva una normale negatività per quanto riguarda l'assimilazione di una certa fonte di carbonio, ma alcuni ceppi della specie sono in grado di assimilare quella stessa fonte di carbonio; la lettera "V" (variabile) viene utilizzata per indicare che alcuni ceppi di una specie sono positivi, mentre altri della stessa specie sono negativi.

Un particolare metodo di identificazione, basato sulle caratteristiche fisiologiche, è il test di fermentazione. Il test di fermentazione dei carboidrati viene utilizzato per determinare se i microrganismi di interesse possono fermentare o meno un carboidrato specifico. Il test verifica la presenza di acido e/o gas prodotti dalla fermentazione dei carboidrati. A seconda degli organismi coinvolti e del substrato che viene fermentato, i prodotti finali possono variare. I prodotti finali comuni della fermentazione comprendono acido lattico, acido formico, acido acetico,

acido butirrico, butanolo, acetone, alcol etilico, anidride carbonica e idrogeno. Per questo scopo viene utilizzato un terreno contenente una singola fonte di carboidrati come glucosio, lattosio, saccarosio o altri. Nel mezzo è presente anche un indicatore di pH (come la soluzione di Andrade, violetto di bromocresolo, blu di bromotimolo o rosso fenolo), che rileverà l'abbassamento del pH del terreno a causa della produzione di acido. Ad esempio, l'andrade a pH neutro (intorno a 7) assume un colore rosa chiaro, mentre a pH più bassi assume un colore rosa-rosso, e a pH più elevati un colore giallo; oppure il viola di bromocresolo assume un colore viola intenso a pH neutri, mentre diventa giallo a pH più bassi; il blu di bromotimolo è verde a pH neutro, giallo man mano che il pH scende. Oltre all'indicatore di pH, all'interno della provetta in cui si sta testando la capacità fermentativa di un inoculo di lieviti, si aggiunge.anche un piccolo tubo invertito (cioè con l'apertura rivolta verso il basso), detto campanella di Durham, che permette di testare la presenza di gas (idrogeno o anidride carbonica) che si possono eventualmente formare in seguito a fermentazione. Se l'organismo produce gas, il gas sposta il fluido presente all'interno della campanella e rimane intrappolato producendo una bolla d'aria visibile. Per eseguire il test si preparano tante provette quanto è il numero di ceppi che si vogliono identificare. Si prepara anche una provetta di controllo (o riferimento) nella quale non viene inoculata alcuna colonia. In tutte le provette viene aggiunto un terreno di base (contenente estratto di lievito e peptoni), il quale viene addizionato di una singola forma di carboidrato, ad esempio glucosio, e di un indicatore di pH. Ciascuna provetta viene inoculata con 10-10 unità formanti colonie del lievito da identificare. All'interno di ciascuna provetta, inoltre,si inserisce una campanella di Durham. Le provette così preparate vengono incubate per 2 o 3 giorni alla temperatura ottimale di crescita. Ovviamente nella provetta di controllo non si osserverà alcun cambiamento. Nelle altre si potrebbe osservare un viraggio di colore unitamente (o indipendentemente) alla presenza di una bolla nella campanella. Il viraggio di colore indica una variazione di pH, che solitamente in questo caso si riduce per produzione di acidi; mentre la formazione della bolla indica che la fermentazione ha portato alla formazione di gas. Se si osserva uno o entrambi i fenomeni allora significa che il microrganismo di interesse riesce a consumare la fonte di carbonio aggiunta inizialmente. Potrebbe succedere che non si osservi nessuno dei due eventi e questo indica che il microrganismo non riesce a usare la fonte di carbonio scelta per attuare la fermentazione. CONTROLLO NEGATIVO: non ci colore (quindi colore)

(venogno osserva alcunsono microrganismi e vengono formati prodotti acidi), ma fenomeno.non si ha viraggio di acidi) e si forma non si formano gascolore e non si forma anche la bolla nella (nella campanellala bolla di gas campanella di non c'è la bolla)Durham

IDENTIFICAZIONE IN BASE ALL'ATTIVITÀ ENZIMATICA

I lieviti potrebbero essere identificati anche in base alla loro attività enzimatica. Nel capitolo dedicato alla identificazione molecolare dei lieviti è stato descritto il modo in cui i lieviti vengono isolati a partire, ad esempio, dalla superficie degli acini d'uva. Per questa tecnica, dopo che l'uva è stata pigiata, si effettuano diluizioni seriali fino a 10^-3. Per l'identificazione dei lieviti in base all'attività enzimatica si eseguono i medesimi passaggi per isolare le cellule dagli acini d'uva ma anziché fare diluizioni seriali fino a 10^-3, si fanno diluizioni seriali fino a 10^-4.

Dopodiché vengono spatolate 100 microlitri-3 -4delle diluizioni 10 e 10 sui terreni WL+Bifenile e Agar Lisina ed, infine, le piastrevengono incubate per 4 o 5 giorni. Successivamente si procede spatolando le coloniesu terreno YPD (Yeast Extract- Peptone-Dextrose Broth). Il tutto viene incubato e, dopoqualche giorno, si può effettuare la valutazione dell’attività enzimatica.l’attività amilasicaAd esempio, si può valutare . Alcuni microrganismiproducono un enzima, l’amilasi, che catalizza l’idrolisi dell’amido a formare glucosio,maltosio e destrine, che vengono poi utilizzati per il metabolismo energetico. Lacapacità di produrre amilasi può essere usata come elemento identificativo.L’accumulo di amido (prelevato dall’ambiente extracellulare) all’interno della cellulapuò essere evidenziato con la soluzione iodio-iodurata di Gram (composta da iodioe ioduro di potassio) che quando viene

in contatto con l'amido forma un complesso blu-marrone. Aggiungendo la soluzione ad un terreno solido contenente amido e una coltura di lievito, si può evidenziare la presenza di amido (che indica quindi l'assenza di amilasi prodotte dal ceppo in coltura) osservando lo sviluppo di colore scuro nel terreno che viene a contatto con la soluzione iodio-iodurata; se invece il ceppo è produttore di amilasi, l'idrolisi dell'amido determina la formazione di un alone chiaro. Ricorda che l'amido viene processato già dall'ambiente esterno per poter attraversare la membrana. L'attività proteolitica. Si potrebbe pensare di valutare anche A tal proposito si potrebbe utilizzare un terreno agarizzato contenente caseina (o meglio, viene aggiunto latte vaccino o latte in polvere, contenente caseina) e valutare, quindi, se i microrganismi isolati possiedono l'enzima caseinasi (che è, appunto, un enzima proteolitico). In generale gli

enzimatica proteolitica.proteolitica del lievito in esame. VALUTAZIONE DELL'ATTIVITÀ KILLER

Per capire se i lieviti isolati dalla superficie degli acini d'uva sono lieviti killer bisogna innanzitutto preparare una sospensione di cellule di un ceppo sensibile alle tossine killer. A questo scopo si procede aggiungendo le cellule all'interno di acqua distillata fino ad ottenere una sospensione con OD6600 (cioè densità ottica, anche detta assorbanza, pari a 600) e vale a dire che nella sospensione ci sono all'incirca 610 cellule sensibili alle tossine killer. 100 microlitri di questa sospensione vengono spalpati su terreno Agar Malto, composto da estratto di lievito, estratto di malto, saccarosio, acqua distillata, agar e tampone citrato-fosfato che mantiene il pH a 4.4. Si lascia asciugare il tutto qualche minuto e poi si fa uno spot dei lieviti presunti killer, che sono stati precedentemente seminati su terreno YPD. Se i lieviti sono lieviti killer, attorno ad essi si

alone, detto alone di inibizione. Di questo si misura il diametro dopo 48 ore a 25°C. VALUTAZIONE DELLA PRODUZIONE DI IDROGENOSOLFORATO L'eccessiva produzione di solfuro di idrogeno (H2S) durante la fermentazione del mosto d'uva è un problema che si verifica molto frequentemente durante la vinificazione. Ciò accade soprattutto perché la concentrazione di composti azotati nel mezzo è scarsa. Per ovviare a questo problema, gli enologi possono aumentare il livello di azoto nel mosto durante la fermentazione aggiungendovi fosfato diammonico (DAP) oppure utilizzare solfato di rame dopo la fermentazione per eliminare l'H2S dal vino. Nonostante l'aggiunta del DAP, in alcuni ambienti il lievito può continuare a produrre H2S e la maggior parte degli enologi preferirebbe non dover utilizzare solfato di rame. I vini che contengono H2S hanno un odore sgradevole (di uova marce) e devono quindi essere trattati (chiarificazione). valutare l'intensità della produzione di idrogeno solforato da parte dei