16 Identificazione dei lieviti in base alle caratteristiche fenotipiche (morfologia, fisiologia e aspetti microscopici)

Identificazione dei lieviti in base alle caratteristiche fenotipiche

I lieviti, isolati dalla superficie degli acini di uva con la tecnica descritta nel capitolo precedente, possono essere identificati anche su base fenotipica e cioè in base alle:

• Caratteristiche morfologiche
• Caratteristiche microscopiche
• Caratteristiche biochimiche e fisiologiche

Identificazione in base alla morfologia

Per apprezzare le loro caratteristiche morfologiche si fanno sviluppare i lieviti isolati su terreni agarizzati. Dopo qualche giorno di incubazione si potrà osservare il colore, la superficie, la consistenza e i margini. Dalla combinazione di queste caratteristiche si potrà risalire a quale ceppo, specie o genere appartiene il lievito in esame. Per esempio, il lievito Hanseniaspora uvarum presenta colore verde intenso, superficie liscia opaca e consistenza burrosa; oppure il lievito Brettanomyces intermedius presenta colore crema, superficie liscia, consistenza cremosa e cellule piccole.

Le cellule isolate possono anche essere poste in terreni liquidi e in questo caso i lieviti vengono assegnati a un determinato ceppo, specie o genere in considerazione di altre caratteristiche: cioè vengono classificati in base al fatto se le cellule si sviluppano liberamente (crescita pulverolenta) o se le cellule si sviluppano solo in superficie (si forma un velo); o se le cellule si accumulano sul fondo (flocculazione).

Identificazione basata su caratteristiche microscopiche

Le cellule possono anche essere osservate microscopicamente e classificate in questo caso in base alla forma delle cellule (sferica, ellissoidale, allungata, ovale, cilindrico, apiculata); modalità di riproduzione; raggruppamenti particolari (catene, pseudomicelio, miceli). Il micelio è una struttura tipica dei lieviti (e dei funghi in generale) costituita da cellule filamentose (settate o meno) dette ife. Lo pseudomicelio è un insieme di cellule filamentose derivate per gemmazione e non separate da setti.

Per effettuare l’osservazione al microscopio di cellule isolate bisogna innanzitutto prelevare una piccola quantità di cellule dalla coltura, utilizzando un’ansa. L’ansa, prima di essere utilizzata, deve essere sterilizzata fino a incandescenza; successivamente l’ansa viene raffreddata poggiandola sul terreno agarizzato dove non ci sono colonie. Una volta raffreddata l’ansa, si può procedere col prelievo della colonia di interesse. La colonia viene, quindi, diluita con una goccia d’acqua direttamente sul vetrino; si poggia un vetrino copri-oggetti e si può osservare al microscopio.

Identificazione in base alla fisiologia

L’identificazione può essere effettuata anche in base a specifiche caratteristiche fisiologiche: per esempio, in base alla capacità di assimilare differenti fonti di carbonio e azoto; o in base alla capacità di svilupparsi in assenza di particolari fattori di crescita; o anche in base alla capacità di resistere a determinati antibiotici e così via.

Per identificare i lieviti in base alla capacità di assimilare una determinata fonte di carbonio piuttosto che un’altra, si procede inserendo uno specifico terreno di coltura, ad esempio l'YNB (Yeast Nitrogen Base), insieme con la sorgente di carbonio appropriata, all’interno di una provetta (o più provette nel caso in cui si volessero identificare più cellule isolate). All’interno della provetta preparata col terreno viene inoculata una goccia della sospensione di cellule con una pipetta Pasteur. Lasciare le provette in incubazione possibilmente con agitazione. La positiva assimilazione della sorgente di carbonio è dimostrata dall’intorbidimento della sospensione.

Se si osserva intorbidimento nell’arco di 7 giorni, l’assimilazione si dice rapida e forte (+); se lo sviluppo (e quindi l’intorbidimento) si realizza solo dopo 14 giorni, l’assimilazione si dice debole (w, che sta per weak che significa debole); se lo sviluppo avviene in 21 giorni, l’assimilazione si dice moderata.