1 Esami ematologici di routine (pt, ptt, tt, emocromo, striscio di sangue, determinazione dei gruppi sanguigni, test di coombs)

Il sangue

Composizione del sangue

Il sangue, pur avendo consistenza liquida, è un tessuto, ed in particolare è un tessuto connettivo. Un adulto possiede da 4 a 6 litri di sangue; la massa sanguigna costituisce circa l’8% del peso corporeo. Esso presenta due componenti: una componente liquida (o plasma) e una componente corpuscolata (globuli rossi, globuli bianchi e piastrine) sospesa nel plasma.

Il 55% del sangue totale è costituito da plasma, che a sua volta è costituito da molte sostanze, tra cui:

• Proteine (7%);
• Molecole organiche (glucosio, aminoacidi, lipidi, ormoni, composti di scarto azotati, come urea);
• Ioni (sodio, potassio, cloro, idrogeno, calcio e bicarbonato);
• Sostanze gassose (ossigeno ed anidride carbonica);
• Vitamine.

La frazione proteica del sangue è costituita principalmente da albumine, globuline e fibrinogeno. L’albumina è la più abbondante proteina presente nel plasma e viene prodotta dal fegato. Essa è importante perché trasporta sostanze di scarto, come la bilirubina, acidi grassi ecc, che vengono poi espulsi con le urine. La bilirubina è un pigmento giallastro che si forma in seguito a degradazione dei globuli rossi vecchi a livello della milza.

In pratica, i globuli rossi vivono per circa 110 giorni, al termine dei quali possono andare incontro a rottura spontanea mentre tentano di passare nei capillari. Per evitare di sprecare il ferro legato al gruppo prostetico EME dei globuli rossi, quelli che vanno incontro a rottura, vengono inglobati in un pigmento detto biliverdina a livello della milza. La biliverdina viene prontamente convertita in bilirubina. La bilirubina deve essere eliminata dall’organismo, ma prima di essere espulsa dovrà essere solubilizzata in acqua. Quindi la bilirubina viene trasportata dall’albumina fino al fegato utilizzando il circolo sanguigno.

Nel fegato, la bilirubina viene associata all’acido glucuronico, formando la bilirubina diglucuronide o bilirubina diretta. La bilirubina che deve essere ancora processata è detta bilirubina indiretta. La bilirubina diretta viene convogliata nella bile, che arriverà all’intestino. Nell’intestino alcuni enzimi rimuovono l’acido glucuronico dalla bilirubina, trasformandola in urobilinogeno. Una piccola quota di questo viene riassorbita dall’intestino, un’altra piccola parte viene ossidata ed eliminata con le urine, una minima parte raggiunge l’intestino crasso e verrà eliminata con le feci.

La piccola parte di urobilinogeno assorbito dall’intestino arriva nuovamente al fegato dove verrà riconiugato con l’acido glucuronico e ripercorrerà la stessa via appena vista. Un’altra proteina plasmatica, sintetizzata dal fegato, è il fibrinogeno o fattore I della coagulazione. Questa proteina viene prodotta con lo scopo di favorire l’emostasi (vedi dopo).

Globuli rossi

I globuli rossi sono le cellule (anucleate) più numerose del sangue, presenti in numero pari a 4-5 milioni/mm³ di sangue. Occupano circa il 40% del volume del sangue. Essendo anucleati sono più propriamente chiamati con il nome di componenti corpuscolate. I globuli rossi presentano una concavità sia sull’una che sull’altra faccia. Inoltre, essendo privi di nucleo, i globuli rossi hanno una vita molto breve.

Molto importante per la funzionalità dei globuli rossi è la membrana di queste cellule. Il primo elemento della membrana è rappresentato dalle glicoforine, che si distinguono in glicoforine A, glicoforine B e glicoforine C. Tutte queste tipologie di glicoforine hanno un alto contenuto di acido sialico, che è un monosaccaride fortemente negativo. Questo significa che ogni globulo rosso è caratterizzato da una carica negativa.

Sapendo che cariche di segno uguale si respingono, i globuli rossi si respingeranno tra loro e mai aderiranno, evitando che avvenga una agglutinazione (unione tra più globuli rossi) all’interno dei vasi più piccoli, dove, cioè, per forza di cose, i globuli rossi sono fortemente ravvicinati tra loro. I globuli rossi non si attaccano nemmeno alle pareti dei vasi, le cui cellule endoteliali sono caratterizzate da proteoglicani, che conferiscono alla parete dei vasi una carica negativa.

Un’altra componente molto importante della membrana dei globuli rossi è la proteina della banda 3, la quale lega e trasporta l’anidride carbonica. Questa viene trasportata attraverso il sangue sotto forma di HCO₃-. Cioè all’anidride carbonica viene aggiunto uno ione OH- per renderla una molecola polare, dato che il plasma è composto per il 90% di acqua. Il citoplasma dei globuli rossi è formato per una grossa percentuale dall’emoglobina.

L’emoglobina è una proteina avente struttura quaternaria, dotata di quattro subunità. Ognuna delle sue quattro subunità è legata ad un gruppo prostetico (non proteico), detto gruppo eme. L’eme ha una struttura ad anello, in cui si riconosce una protoporfirina che circonda un atomo di Fe, avente ossidazione +2. Il ferro forma quattro legami distinti con quattro distinti atomi di azoto facenti parte dell’anello porfirinico. Gli atomi di azoto legati al ferro fanno sì che l’atomo di ferro non si ossidi da +2 a +3.

Bisogna evitare questo perché il ferro nello stato di ossidazione +2 lega reversibilmente l’ossigeno; nello stato di ossidazione +3 non è in grado di legare questo gas e può, invece, legare l’acqua. Le quattro catene polipeptidiche (cioè le quattro subunità) dell’emoglobina sono uguali a due a due: si distinguono due catene α e due catene β. Dall’analisi ai raggi X, è stato possibile vedere che l’emoglobina è presente in due conformazioni: lo stato R (rilassato) e lo stato T (teso).

L’ossigeno ha una maggiore affinità per lo stato R, che viene stabilizzato per mezzo dell’interazione con il gas, mentre lo stato T è quello più stabile in assenza di ossigeno ed è la conformazione della cosiddetta deossiemoglobina. Ogni subunità dell’emoglobina lega una molecola di ossigeno, quindi ogni emoglobina lega e trasporta quattro molecole di ossigeno. La prima molecola di ossigeno lega l’emoglobina che si trova nello stato T (teso), quindi avrà parecchia difficoltà a legare una delle subunità.

Nel momento in cui questa prima molecola di ossigeno lega l’emoglobina, la proteina modifica il suo stato e passa dallo stato T allo stato R. Pertanto le altre tre molecole di ossigeno che legheranno l’emoglobina saranno più facilitate a interagire con le varie subunità. Il legame in questione, proprio per questa dinamica, prende il nome di legame cooperativo. Una proteina il cui ligando modifica la conformazione della proteina stessa è detta proteina allosterica. L’emoglobina è una proteina allosterica.

Nei tessuti periferici, in cui il pH è basso, la concentrazione di CO₂ è alta, l’affinità dell’emoglobina per l’O₂ è ridotta e il gas viene rilasciato nei tessuti. Nei polmoni, invece, l’anidride carbonica viene espulsa e, quindi, si trova in piccolissime quantità. Ciò fa sì che l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno sia elevata e il gas può legarsi all’emoglobina per essere trasportato ai tessuti.

Il monossido di carbonio (CO) ha una affinità per l’emoglobina di circa 250 volte maggiore rispetto all’ossigeno. Il monossido di carbonio viene prodotto, ad esempio, dal fumo delle sigarette e quando è presente in concentrazione maggiore rispetto all’ossigeno legherà l’emoglobina che, a sua volta, prenderà il nome di carbossiemoglobina. In un individuo sano meno dell’1% dell’emoglobina totale è presente sotto forma di carbossiemoglobina.

Globuli bianchi e piastrine

Oltre ai globuli rossi, sono costituenti della componente corpuscolata anche i globuli bianchi (o leucociti), che sono le cellule propriamente dette del sangue e, quindi, le cellule nucleate che si presentano nel sangue. I globuli bianchi sono presenti in numero minore rispetto agli eritrociti (globuli rossi); si contano circa 4.000-8.000 globuli bianchi in un mm³ di sangue.

Esistono due grandi famiglie di globuli bianchi: la famiglia dei granulociti (o polimorfonucleati) e la famiglia degli agranulociti. I primi hanno al loro interno una elevata quantità di granuli e possiedono un nucleo polilobato da cui deriva il nome (polimorfonucleati); gli agranulociti non hanno granuli evidenti (ma sono comunque presenti) ed hanno un nucleo che non è mai formato da più lobi.

I granulociti possono uscire dal sangue ma non possono rientrarvi, differentemente dagli agranulociti che possono uscire e rientrare in modo molto libero dal vaso sanguigno. La famiglia dei polimorfonucleati comprende tre tipologie di cellule: i neutrofili, i basofili e gli eosinofili; la famiglia degli agranulociti comprende due tipologie di cellule: i linfociti e i monociti.

Una caratteristica peculiare del nucleo dei neutrofili è la presenza del cosiddetto Drumstick o corpo di Barr (cromosoma X inattivo), presente nei neutrofili degli individui di sesso femminile. I granuli presenti all’interno dei neutrofili prendono il nome di granuli primari o azzurrofili. Essi contengono importanti enzimi, come idrolasi, catalasi, fosfatasi acida e il lisozima. Ai granuli primari si accompagnano anche i granuli secondari, contenenti molecole come collagenasi, lattoferrina, e il lisozima. In ultimo, sono presenti anche i granuli terziari, contenenti la gelatinasi.

I neutrofili hanno generalmente una vita molto breve. I granuli primari e secondari sono presenti anche all’interno degli eosinofili. All’interno dei granuli secondari degli eosinofili è presente la proteina basica maggiore (MBP). La vita media di un eosinofilo è leggermente più lunga di quella di un neutrofilo. Anche nei basofili si presentano granuli primari e granuli secondari. In questi ultimi sono presenti istamina ed eparina.

Per quanto riguarda i linfociti, sappiamo che esistono i piccoli linfociti e i grandi linfociti. I piccoli linfociti possono essere, a loro volta, di due tipi: linfociti B e linfociti T. I leucociti rappresentano in generale una popolazione cellulare eterogenea che assolve a funzioni di difesa grazie alla loro capacità migratoria (diapedesi) per raggiungere sedi opportune per esplicare la loro funzione.

Insieme ai globuli rossi e ai globuli bianchi, le piastrine costituiscono la componente corpuscolata del sangue. Le piastrine derivano da una cellula che prende il nome di megacariocita e si formano mediante distacco laterale di pezzi del citoplasma del megacariocita. Le piastrine sono presenti in numero minore rispetto ai globuli rossi, ma maggiore rispetto ai globuli bianchi (si contano 150.000-400.000 piastrine in un litro di sangue).

Nella piastrina distinguiamo una zona centrale più scura (cromomero) e una porzione periferica più chiara (ialomero). Cromomero e ialomero sono entrambe porzioni di citoplasma; il cromomero è più scuro perché contiene un grosso numero di granuli. Tra questi granuli si ricordano i granuli α, che contengono fattori della coagulazione e fattori della crescita; granuli δ, che contengono ioni calcio, ADP, fattori della coagulazione e la serotonina; e granuli λ, che contengono idrolasi.

Le piastrine producono anche le prostaglandine, molecole molto importanti nel processo di coagulazione. Le piastrine sono, inoltre, gli attori principali che intervengono nel processo di riparazione delle ferite. Questo processo di riparazione è detto, più specificatamente, emostasi, cioè mantenimento del sangue all’interno dei vasi.

Emostasi e coagulazione

L’emostasi si sviluppa in due fasi: la prima è l’aggregazione piastrinica; la seconda è la coagulazione. In condizioni normali le piastrine producono le prostaglandine G2. Queste arrivano a livello delle cellule endoteliali dei vasi e vengono convertite in prostacicline. Le prostacicline vengono ricaptate dalle piastrine e le inattivano: in un certo senso le piastrine capiscono che tutto va bene. Se c’è un’interruzione nel vaso, succede che le prostaglandine G2, prodotte dalle piastrine, vengono convertite in prostacicline da parte delle cellule endoteliali della parete del vaso in tutte le parti tranne laddove è presente l’interruzione, cioè la ferita.

Nel momento in cui la piastrina “vede” che è presente ancora una piccola percentuale di prostaglandina G2, si attiva. Da questo momento inizia l’aggregazione piastrinica, cioè le piastrine cambiano forma e si associano tra loro nel punto in cui il vaso è stato danneggiato e rilasciano serotonina, che è un potente vasocostrittore. Inizialmente la vasocostrizione è un evento di natura nervosa riflessa; solo successivamente è sostenuta dal rilascio di serotonina.

Se il vaso danneggiato è un capillare, l’arresto dell’emorragia può essere affidato unicamente a questo meccanismo. Al contrario, se il vaso danneggiato è di più grandi dimensioni, successivamente alla vasocostrizione, le piastrine rilasciano il contenuto dei granuli α e, quindi, il fibrinogeno. Il fibrinogeno, prodotto da tutte le piastrine, va a costituire un tappo che chiude la zona lesionata. Si parla, quindi, di trombo bianco o coagulo provvisorio. Si conclude così la fase dell’aggregazione piastrinica.

In seguito, le piastrine producono i fattori della coagulazione e comincia la fase della coagulazione piastrinica. Questa fase ha come scopo ultimo la conversione del fibrinogeno in fibrina.

Test di laboratorio per lo studio dell'emostasi (provetta celeste)

In presenza di un sanguinamento dovuto, ad esempio, ad un trauma o un taglio, si attiva il processo emostatico (emostasi), un complesso processo che porta alla formazione del coagulo sanguigno tramite l’attivazione sequenziale di numerosi fattori della coagulazione; tale processo prende il nome di cascata coagulativa. La cascata culmina con la formazione di una rete insolubile di fibrina in grado di creare, insieme alle piastrine, un aggregato e formare così un tappo stabile.

La formazione del coagulo determina l’interruzione della perdita ematica e consente la riparazione del danno tissutale. Il processo coagulativo è un processo di tipo dinamico; esistono infatti altri fattori in grado di dissolvere il coagulo in un processo noto con il nome di fibrinolisi. Nei soggetti sani infatti, dopo la riparazione del danno tissutale, il coagulo viene rimosso. L’equilibrio tra formazione e distruzione del coagulo assicura l’assenza di sanguinamento eccessivo ma anche l’eccessiva formazione dei coaguli qualora questi non siano più necessari.

I fattori della coagulazione, in generale, sono delle proteine e sono conservate nei granuli delle piastrine e riversate nel plasma al momento opportuno. Il sistema della coagulazione è un sistema coinvolto in numerose funzioni: viene attivato anche in seguito, ad esempio, a una risposta infiammatoria allo scopo di rendere il sangue meno fluido e, quindi, di rendere più difficile la diffusione di eventuali patogeni.

La produzione dei fattori della coagulazione richiede come elemento essenziale la presenza della vitamina K. Questa esiste in tre forme: vitamina K1, K2, K3. A livello del fegato, la vitamina K svolge un ruolo molto importante nella γ-carbossilazione di alcuni aminoacidi, presenti nella struttura dei fattori coagulativi. Questa carbossilazione rende questi residui particolarmente negativi con conseguente attrazione del Ca²⁺, che attiva i fattori stessi. Senza la vitamina K, quindi, vengono prodotti fattori della coagulazione la cui attivazione è molto difficoltosa. Questa reazione di carbossilazione si verifica nella sintesi dei fattori della coagulazione II, VII, IX e X.

Gli eventi che innescano una cascata coagulativa sono due. Ci sarà, infatti, una via intrinseca e una via estrinseca. Nel caso della via estrinseca, il primo complesso che si forma è costituito dal fattore VII della coagulazione e dal TF (fattore tissutale o fattore III o tromboplastina). Il TF è espresso sulla superficie di quelle cellule che normalmente non sono esposte a sangue fluente; ad esempio è espresso sulla superficie delle cellule sub-endoteliali del vaso sanguigno (ad esempio le cellule muscolari).