Zoologia

Tassonomica - Concetti Generali

1) Gli acidi nucleici vanno liberati dal legame con le proteine e dai lipidi i membrana citoplasmatica e nucleare.

2) Estrazione degli acidi nucleici dal miscuglio di composti che ne risulta.

3) Separazione degli acidi nucleici da eventuali contaminanti.

4) Conservazione degli acidi nucleici in condizioni chimico-siche idonee e compatibili con le analisi e gli eventuali utilizzi successivi.

Gli acidi nucleici possono essere estratti a partire da diversi tessuti biologici, ma anche da sezioni incluse in para na, liquidi biologici (plasma/siero) o colture cellulari derivate dai diversi tessuti biologici.

Mentre il DNA è una molecola molto stabile e non necessita di particolari accorgimenti, l'RNA deve invece essere preservato fino all'arrivo in laboratorio. Questo è possibile attraverso l'RNA Later che contiene degli inibitori di ribonucleasi (=enzimi che degradano l'RNA). Se il campione da estrarre è già presente in laboratorio,

si può procedere con losnap freezing, ossia un congelamento rapido a -196°C, che è la temperatura dell'azoto liquido. Estrazione degli acidi nucleici ↳ è composta da 4 fasi: 1) Lisi delle membrane 2) Rimozione delle proteine 3) Precipitazione dell'acido nucleico 4) Solubilizzazione Estrazione RNA/DNA con metodo fenolo/cloroformio Lisi delle membrane con trizol (tiocianato di guanidina), che è sufficiente se si tratta di una coltura cellulare. Per il tessuto va associata la lisi meccanica, fatta con onde sonore ad alta frequenza. L'energia prodotta, produce delle bolle di vapore che implodono causando onde d'urto. - Dopo la centrifugazione si ottengono 3 fasi: - fase acquosa: contenente gli acidi nucleici, - interfase: di proteine denaturate, - fase fenolica: contenente lipidi, proteine solubili (e, usando un pH acido, DNA). Precipitazione Precipitazione in isopropanolo che

Spesso viene fatta overnight, per aumentare la concentrazione di acido nucleico precipitato. Solubilizzazione avviene in acqua DPC (Dietilpirocarbonato) - un potentissimo inibitore di ribonucleici che rende l'acqua priva di qualsiasi nucleasi.

Estrazione RNA/DNA con colonnine: utilizzo di colonnine formate da membrane con alta affinità per gli acidi nucleici. La procedura di estrazione è semplice e veloce, con alta resa, che garantisce campioni caratterizzati da purezza ed integrità.

Gli step sono:

1. Legame alla membrana
2. Lavaggio della membrana per rimuovere lipidi e proteine
3. Eluizione dell'acido nucleico

Il principio su cui si basa questo metodo è quello dell'utilizzo di membrane a scambio anionico - le cariche positive presenti sulla membrana, costituita da gel di silice, interagiscono con le cariche negative dei gruppi fosfato di DNA e RNA. È quindi necessario includere un passaggio di rimozione dell'acido nucleico indesiderato RNAsi per.

estrarre DNA/ DNAsi per estrarre RNA.

Quantificazione acidi nucleici

Una volta estratti, gli acidi nucleici devono essere quantificati. Il principio della quantificazione avviene attraverso il metodo spettro-fotometrico che si basa sull'assorbimento atomi o molecole presenti in soluzioni possono assorbire quantità definite e caratteristiche di energia. L'assorbimento è direttamente proporzionale alla concentrazione.

Lo spettro-fotometro può fornire anche informazioni relative alla purezza dell'RNA.

INTEGRITà DNA/RNA

Un'ulteriore conferma del processo di estrazione si può avere facendo 'correre' il campione all'interno di un campo elettrico controllato.

Elettroforesi su gel d'agarosio

Questa tecnica sfrutta il principio per cui delle molecole cariche si muovono in un campo elettrico verso il polo opposto - gli acidi nucleici, che hanno carica negativa dovuta alla presenza dei gruppi fosfato, sono attratti dal polo.

positivo.I pozzetti vengono riempiti con la soluzione di DNA o RNA. Il gel è costituito da Agorosio al 2% diluito in una soluzione tamponata, che molecolare fungerà da "setaccio" facendo correre più velocemente all'interno del campo elettrico le molecole con dimensioni minori. Al termine della corsa elettroforetica il gel verrà posto sotto una lampada UV e ci fornirà informazioni sul peso molecolare della banda.

Retrotrascrizione

Una volta valutata la concentrazione, la purezza e l'integrità del campione, si procede con la retrotrascrizione. L'RNA è una molecola particolarmente labile dato che all'interno della cellula è presente come singolo filamento. È quindi necessario trasformarla in una molecola di DNA complementare = cDNA (retrotrascrizione/ trascrizione inversa)...

porzioni non codi canti. La retrotrascrizione è possibile grazie ad enzimi chiamati DNA polimerasi RNA dipendenti, poiché riescono a produrre una molecola di DNA a partire da una di RNA. Per iniziare la reazione di polimerizzazione sarà necessario l'utilizzo di primer = oligonucleotidi complementari alla zona di interesse.

Le trascrittasi inverse usate per la retrotrascrizione sono enzimi ricombinanti modificati per avere un basso tasso di errore.

Amplificazione del trascritto

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è definita come l'amplificazione selettiva in vitro di una sequenza di DNA/cDNA grazie a primer specifici.

...

disegnati per avere al loro interno

la………………………………………………….sequenza di interesse. Saranno una coppia di………………………………………………….oligonucleotidi uno complementare al lamento………………………………………………….5’- 3’ e l’altro complementare al lamento 3’- 5’.………………………………………………….Questo permetterà alla polimerasi di copiare………………………………………………….entrambi i

lamenti target.fi fi fi fi fi fi fi fi fi

La PCR consiste nella ripetizione, per un dato numero di cicli, di tre fasi:

1. Denaturazione - è necessaria una polimerasi termostabile che non viene denaturata (95°C) se portata a elevate temperature. Consiste nella divisione dei due lamenti di DNA.
2. Allenamento (60°C) della sequenza target con i rispettivi primer.
3. Allungamento (72°C) - a questa temperatura l'enzima riesce a polemizzare la sequenza target.

DNA polimerasi DNA dipendente - enzimi appartenenti alla categoria dell trasferasi. Caratterizzano la reazione di polimerizzazione, cioè sono in grado di sintetizzare un lamento di DNA a partire sempre da un lamento stampo. La DNA polimerasi più utilizzata è la Taq polimerasi, che è stata isolata dal batterio Thermophilus acquaticus presente abitualmente nei geyser. Questa polimerasi è quindi particolarmente termo-resistente. Alcune Taq sono state modificate per avere anche

Attività di proofreading, che consente la correzione e la rimozione di nucleotidi erroneamente inseriti durante il processo.

La reazione a catena della polimerasi è caratterizzata da 3 fasi principali:

• Esponenziale: raddoppiamento delle copie di DNA presenti
• Lineare: progressiva diminuzione dei componenti necessari alla reazione
• Plateau: all'aumentare dei cicli la quantità di prodotto finale sarà sempre stabile.

Conservazione

Il DNA è caratterizzato da una struttura stabile e poco reattiva, quindi può essere conservato a 4°C.

L'RNA, al contrario, è una struttura estremamente labile essendo presente in singolo filamento e facilmente degradato dalle ribonucleasi. L'estrazione di RNA impone condizioni di sterilità e di particolare accuratezza, l'uso di vetreria e reagenti sterili e dedicati esclusivamente a quello scopo. Va conservato a -70°C in condizioni denaturanti, quindi.

Insoluzioni come la formaldeide. È per questi motivi che risulta conveniente retrotrascrivere l'RNA prima della conservazione per avere un campione di DNA complementare che risulta più stabile e meno reattivo.

Tecniche di immagine per osservazione di organismi e tessuti di vertebrati ed invertebrati:

• Microscopio ottico: tipologia di microscopio che sfrutta la luce con lunghezza d'onda all'interno dello spettro visibile. La luce di una lampada passa attraverso un condensatore e attraversa il vetrino, con il campione posto su una piastra portaoggetti. La lente su cui si poggia l'occhio è detta oculare.
• Microscopio elettronico: ha un funzionamento basato su fasci di elettroni, che avendo bassissime lunghezze d'onda permettono l'ottenimento di risoluzioni molto più elevate. È possibile quindi vedere microrganismi e strutture cellulari più piccole del limite di risoluzione del microscopio ottico.

Vengono usate lenti all'altra estremità del tubo si trova una elettromagnetiche che garantiscono l'alente detta obiettivo. Quest'ultima presenza di campo elettrico e magnetico focalizza l'immagine del campione a e deviano il fascio di elettroni per poter livello dell'oculare ottenendo un ulteriore rendere visibile il campione. ingrandimento. L'immagine è poi vista dall'osservatore come se essa fosse posizionata a 250mm dall'occhio. →La risoluzione il potere risolutivo di un microscopio è la capacità di riconoscere come distinti due punti estremamente vicini tra loro. La distanza minima alla quale due punti sono visti come distinti si chiama limite di risoluzione. Il microscopio ottico ha un limite di risoluzione di 0,2 µm. Il microscopio elettronico ha una risoluzione di 0,005 nm. L'occhio umano ha invece un potere di risoluzione di circa 100 µm. Per avere una visione nitida dell'immagine, n