Vascolarizzazione di scaffold

Approccio semplice

 Non devo passare per uno step in vitro. Ho lo scaffold, metto i

 fattori, impianto.

× i fattori di crescita sono molecole molto costose

× c è il rischio di indurre una crescita incontrollata di tess e di

generare una massa tumorale. Questa è una questione dibattuta

su cui non c è unanimità.

× La forma della rete vascolare non è prevedibile, dipende dal

soggetto, non riesco a programmare la distribuzione della

rete vascolare all interno dello scaffold, quindi non è

riproducibile e può non essere omogenea.

2) Bioreattore:

Stimolo lo scaffold con alcune forze, es un flusso, dopo averci

messo delle cell endoteliali, mi aspetto che ci sia alla fine una

direzionalità nella crescita dei vasi. Poi impianto. Devo mettere cell

autologhe, qunidi devo prelevarle, farle espandere, ecc qunidi ci vuole

tempo e devo sterilizzare tutti i passaggi. Infatti questo approccio non è

molto usato.

3) Sistemi microfluidici (soft litography):

Sono modelli 3d in vitro di reti microvascolari con un pattern

specifico. Sono reti di canali che vengono perfuse da sospensioni di

cell endoteliali, queste colonizzano le pareti dei canali e formano l

endotelio, che mima quello naturale.

Es.

Stampo in silicone. Controstampo in gelatina per due volte, con canali

semicircolari, con gelatina parzialmente reticolata con

transglutaminasi. Si uniscono le due metà, completando la

reticolazione. Così si forma una struttura a canali circolari e di raggio

decrescente (centinaia di micron). Le due barre laterali rosse servono

per sovrapporre correttamente i due emistampi, che hanno due fori e

vengono inseriti nelle barre perché siano allineati. Soft litography.

Se ho la gelatina reticolata con l mTg posso avere modelli più complessi,

perché sulla parete dei vasi metto le cell endoteliali, dentro la

gelatina posso mettere le cell che voglio studiare mentre reticola

perché l mTg non è tossico.

Es.

All interno dello scaffold (in rosa) è stato creato un microcanale dove

sono state seminate le cell endoteliali. Nella matrice di idrogelo di

collagene sono state seminate cell tumorali, perché sono in grado di

richiamare cell endoteliali e di promuovere la formazione di nuovi

vasi per rilascio di fattori pro-angiogenici, il tumore è una massa di

tessuto con una rete vascolare all interno molto random che si genera

grazie alla crescita veloce di queste cell. Qunidi questo modello

voleva capire se queste cell tumorali all interno del collagene

stimolassero la crescita di vasi anche all interno della matrice di

collagene.

4) 3d-printing (fresh printing):

Vengono realizzato un network di canali all interno dello scaffold,

costituiti da un materiale sacrificale, che dopo la stabilizzazione

dello scaffold verrò rimosso selettivamente, lasciando delle cavità. I

canali verranno perfusi da una sospensione di cell endoteliali che

formeranno i vasi.

Posso progettare la configurazione della rete vascolare

 gerarchia nel calibro dei vasi, es si parte da una geometria con

 diam grande e si fanno ramificazioni di diam +piccolo

Si possono usare 3 tecniche:

- elettrospinning coassialevasi piccoli

- 3d printing grandi

vasi

- Stereolitografiavasi piccoli

Il mat sacrificale deve poter essere disciolto e eliminato senza

alterare lo scaffold. Es se ho il PLA che è idrofobico necessiterebbe di

un solvente inorganico quindi no. Es di mat sacrificali:

- Il pluronic, eliminato con acqua

- Il PVA, si elimina con acqua

- Zuccheri, zucchero vetrificato tipo caramello, es agarosio

- La gelatina, la elimino alzando la T

- Alginato, con soluzione chelante di ca++

- Pnipaam, andando sotto i 32°

Es. Strutture in zucchero vetrificato

Es. rete vascolare 3d.

In quelli di prima avevo delle reti 2d, allora posso pensare di

sovrapporne tante ma non si parlerebbero non avrebbero

connessione.

Es. alginato stampato in 2d e reticolato con CaCl2, all interno di

gelatina reticolata. Eliminato per immersione in soluzione

chelante di Ca++.

Questo scaffold con questo canale può essere collegato a un arteria

presente nel tess in cui impianto lo scaffold. Qui è stata introdotta un

arteria di ratto, è stata incollata con colla di fibrina.

Es. Qui struttura in agarosio, stampata con bioprinting (cell endoteliali).

Per la tridimensionalità sono stati usati 3 canali, sono stati inglobati nel

mat GelMA/PEGdA poi reticolato con uv, con cell all interno. Agarosio poi

rimosso per aspirazione o in modo manuale.

Es. Struttura 3d in PVA. All interno di gelatina reticolata con mTG. Poi

rimossa con acqua.

5) Matrici naturali decellularizzate

Sulla foglia ci sono dei canali di aspetto gerarchico, quindi imita

bene le condizioni in vivo.

Non impiantiamo la foglia ma la decellularizziamo: si mantiene la

ecm, tolgo le cell, così non ho problemi di risposta immunitaria

quando impianto. Su tess umani o animali. Ma anche su vegetali. Qui

foglia di spinacio. Nel tempo perde colore perché viene tolta la

clorofilla e le cell. Rimane una strutt trasparente fatta di cellulosa

con i canali all interno. Da inglobare poi nello scaffold.

Si sono perfusi i vasi all intenro di questi canali. Si possono

seminare all interno cell endoteliali. In B perfusione con liquido. In C

hanno messo delle microsfere e hanno misurato quante riescono a

perfondere la struttura, che dipende dalla gerarchia di calibro

dei canali, le sferette più grandi passano poco, per misurare la

dimensione dei canali.

Poi ci hanno seminato cell endoteliali, le HUMVEC che sono molto

usate e di linea, hanno colonizzato la parete quindi ok.

Es. matrici decellularizzate

1. Vegetali con sviluppo 3d per avere reti 3d. Decellularizzazione

2. Sono stati analizzati al sem per misurare la dimensione dei

canali.

3. Poi inglobate in scaffold di gelma, poi reticolazione

4. Poi prove di stabilità e meccaniche, perché stiamo inserendo

una struttura all interno di un idrogelo, le prove di stabilità per

capire se la presenza di questa struttura influenza la cinetica di

degradazione o se influenza il processo di reticolazione della

gelatina, propr mecc per capire l influenza sullo scaffold in

gelatina se aumentano o diminuiscono

5. test biologici per vedere la vitalità.

1. Nelle tre strutture ho una distribuzione delle dimensioni diversa. Faccio

un confronto con i canali del corpo umano. I vegetali si trovano in un

range compreso tra 10-30 micron del corpo umano qunidi vanno bene.

Caratterizzazionechimico-fisica. Variazione ponderale %. Sono stati

presi i campioni, sono stati messi in acqua, lo scaffold è stato poi

pesato. All inizio ho una diminuizione di peso, perché quando

reticolo la gelma la reticolazione dipende dal grado di funzionalizzazione

ovvero quanti gruppi MA ho sulla gelatina che possono reagire per

reticolare e la parte di gelatina non reticolata che è liquida a 37°

esce dallo scaffold. Poi ho l aumento di peso dovuto allo swelling. I

canal non ha influenzato neg in modo significativo la reticolaz della

gelma.

Ma se volgio vedere

quanta massa è

presente al netto dell

acqua assorbita, qundi si

calcola il parametro di

frazione solida (gel fraction). Dopo il freeze-drying. Vedo che non

ho una perdita di gelatina, a parte quella iniziale non retic. La cellulosa

non si degrada e non influenza la reticolazione.

Poi prove di perfusione per iniezione di

colorante inerte

Poi prove meccaniche. Misuro rigidezza E. Ho caratt mecc diverse a

seconda della strutt veg inglobata. Quindi posso mimare un tess adiposo

o tumore e quindi mimare diverse patologie/condiz fisiologiche.

Prove di citotossicità. Nella decellularizzazione potrebbero esserci

residui del processo o rilasciati dalla matrice decell stessa. Poi di

citocompatibilità, usando preadipociti.

Studio per vedere se i preadipociti oltre ad aderire si differenziavano

Es. 3d printing, fresh printing

- Direct printing: stampa di strutture all interno di un bagno

sacrificale, come un idrogelo. Perché certe strutture 3d non sono in

grado di reggersi da sole e quindi uso un idrogelo come mat di

supporto che permette all ago di muoversi e stampare sull asse x y

e z formando strutt 3d, con dei mat che non sarebbero stampati 3d

senza l ausilio di questo bagno di supporto. Qunidi poi si elimina il

bagno e si ottiene la strutt 3d

- Indirect printing: si stampa la struttura all inetrno del bagno,

la struttura è il mat sacrificale che lascia i canali vuoti dopo l

eliminazione mentre il bagno è lo scaffold in idrogelo da

gelificare