Trasporto della dopamina nella Malattia di Parkinson

Queste tecniche sono state utilizzate anche per esaminare l'immunoreattività

di DAT e VMAT2 nel cervello di scimmia emiparkinsoniana (vedi Fig. 3) (5,6). La

somministrazione unilaterale di 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP)

distrugge selettivamente i terminali della dopamina nel caudato e nel putamen,

ma risparmia altre regioni monoaminergiche. Pertanto, l'analisi immunochimica

dei trasportatori della dopamina nella malattia di Parkinson idiopatica e

sperimentale fornisce un mezzo eccellente per valutare l'integrità neuronale.

Il tampone deve essere preparato settimanalmente a causa della possibilità di

crescita batterica. Tutti i seguenti articoli sono disponibili presso Invitrogen

(Carlstad, CA): tampone per campioni (NP0007), tampone per la corsa

(NP0001), tampone per il trasferimento (NP0006), marcatori di peso

molecolare, gel e apparecchi. Altre aziende producono sistemi eccellenti per

l'esecuzione e il trasferimento dei gel, in particolare Bio-Rad (Hercules, CA).

Anche i gel prefusi sono ora disponibili da diverse fonti. L'acquisto di gel

prefabbricati elimina virtualmente i problemi di gel che perdono o non uniformi

che hanno frustrato molti ricercatori. Molti di questi gel hanno una durata di

conservazione fino a 1 anno.

I gel di tris-glicina sono stati i gel preferiti per molti anni, ma i formati più

recenti, tra cui il sistema NuPAGE (Tris-bicine) di Novex, hanno una durata di

conservazione molto più lunga e tempi di esecuzione più brevi. Utilizziamo un

buffer di carico convenzionale con il sistema NuPage, come descritto al

paragrafo 2., ma Novex produce anche un buffer di carico realizzato

appositamente per il proprio sistema. Si consiglia vivamente a un nuovo utente

di un microtomo di chiedere consiglio a un utente esperto o di utilizzare le

strutture istologiche di base. Diverse sottigliezze esulano dallo scopo di questo

capitolo. Due problemi comuni sono non mantenere il blocco di tessuto

congelato durante la procedura e non mantenere una velocità di taglio

costante. Il ghiaccio secco deve essere aggiunto al tavolino a intervalli

frequenti e la lama deve muoversi attraverso il tessuto con un movimento

fluido. L'uso del movimento del polso e delle dita per far avanzare la lama

attraverso il tessuto, piuttosto che muovere la spalla e il gomito, aiuterà a

mantenere il controllo motorio fine necessario. Le sezioni di tessuto devono

essere raccolte in un vassoio diviso, posizionando ogni sezione successiva nel

pozzetto successivo e ripetendo l'operazione per tutto il blocco di tessuto.

Questo genera più serie che possono essere utilizzate per confrontare diversi

marcatori in sezioni adiacenti. Più serie hai, più distante è ogni sezione

all'interno di una serie. Per i tessuti di scimmia e umani, tuttavia, di solito

vengono utilizzate 12 o più serie. Le sezioni di tessuto fresco congelato

vengono generalmente tagliate su un criostato. L'azide di odio è molto tossica.

Il DAB è un noto cancerogeno. Indossare i guanti quando si lavora con questi

reagenti.

Il siero utilizzato per le fasi di blocco deve essere lo stesso di quello

dell'anticorpo secondario. Vector Laboratories produce anticorpi secondari nella

capra che riconoscono ratto, coniglio o topo; Quindi usiamo la capra quando

usiamo questi kit. Abbiamo scoperto che nei tessuti umani e di scimmia

l'aggiunta del 4% di siero umano aiuta a ridurre lo sfondo. Il successo di

qualsiasi tecnica immunochimica dipende dalla qualità degli anticorpi utilizzati.

Per questo motivo, è imperativo utilizzare anticorpi ben caratterizzati. Prima di

acquistare gli anticorpi, verificare i riferimenti forniti nei cataloghi per verificare

se gli anticorpi sono stati completamente caratterizzati. Dovrebbero essere

stati testati mediante Western blotting e immuncitochimica nelle specie che

intendi studiare. In caso contrario, potresti voler richiedere un piccolo campione

per vedere se funziona nella specie di interesse. Per ulteriori informazioni sulla

caratterizzazione degli anticorpi, vedere il rif. 6. La concentrazione ottimale di

ciascun anticorpo deve essere determinata mediante titolazione, ma una

concentrazione finale di anticorpi purificati per affinità di circa 0,5 μg/mL di

solito produce risultati eccellenti. Da Chemicon sono disponibili anticorpi

eccezionali sia per DAT (monoclonale) che per VMAT2 (policlonale). Diverse

aziende producono kit di rilevamento per l'immunocitochimica. Abbiamo avuto

la massima esperienza con i kit Vector Vectastain Elite ABC. Ogni kit è

progettato per riconoscere una particolare specie di anticorpi primari. Se si

utilizza un anticorpo primario monoclonale di topo, si acquista il kit per topi. I

kit contengono il particolare anticorpo secondario biotinilato (A) e i componenti

del complesso avidina-perossidasi (B+C). I kit ABC contengono anche una

piccola quantità di siero bloccante, che generalmente scartiamo. Per un piccolo

pezzo di tessuto, 500 μl in una provetta da microcentrifuga funzionano bene. Il

pellet risultante contiene membrane e le proteine associate. Il superna-tant

contiene proteine citosoliche (ad esempio, tirosina idrossilasi). Un esempio di

una quantità appropriata di tampone potrebbe essere di circa 200-300 μl per

un punzone da 2-3 mm profondo 2-3 mm. Non bollire. Le alte temperature

possono provocare la dimerizzazione delle proteine trasportatrici. È molto

importante non avere bolle tra il gel e la membrana PVDF. Abbiamo riscontrato

che la seguente procedura funziona bene, ma anche altri metodi funzionano

bene. Metti un pezzo di pellicola di cellophane sulla panca (1 × 1 piede).

Immergere un pezzo di carta da filtro nel tampone di trasferimento e

posizionarlo sulla pellicola. Quindi posizionare la membrana PVDF sulla carta da

filtro. Versare diversi millilitri di tampone di trasferimento sul PVDF. Il liquido

dovrebbe accumularsi sulla membrana. Quindi, tenendo il gel dai lati,

posizionare delicatamente il centro del gel al centro della membrana e lasciare

i lati delicatamente sulla membrana, spingendo fuori il tampone. Prendi un

altro pezzo di carta da filtro e posizionalo sopra il gel. Quindi, utilizzando una

pipetta di plastica pulita, arrotolare delicatamente il filtro dal centro verso

l'esterno. Questo rimuove le bolle tra il gel e la membrana. Ricorda che il gel è

rivolto verso l'alto, il che significa che vuoi che la corrente scorra attraverso il

gel nella membrana.

Abbiamo scoperto che una piccola quantità di latte scremato in polvere nella

soluzione anticorpale primaria aiuta a ridurre lo sfondo. Produciamo una

soluzione al 2,5% utilizzando un terzo di volume di soluzione bloccante con due

terzi di volume di TTBS. Si consiglia un sigillante a impulsi con sacchetti di

polietilene. Sigillare la sacca su tre lati, aggiungere la soluzione di anticorpi

primari (3-5 ml) e sigillare l'estremità aperta mentre si spingono delicatamente

le bolle fuori dalla sacca. Preferiamo agitare il blot con uno shaker rotante.

Utilizzare un anticorpo secondario purificato per affinità contro l'anticorpo

primario accoppiato alla perossidasi di rafano (HRP). I sistemi di imaging sono

ora in grado di rilevare direttamente la chemiluminescenza. Abbiamo scoperto

che il substrato Dura Western di Pierce (Rock-ford, IL) funziona bene con questi

sistemi. I nuovi sistemi di imaging possono migliorare la quantificazione poiché

le telecamere hanno una gamma dinamica molto più ampia rispetto alle

pellicole radiografiche convenzionali. L'immunoreattività diminuirà dopo lo

stripping. Tuttavia, abbiamo riscontrato che è possibile sondare il blot per un

totale di tre volte con buoni risultati. Si consiglia di sondare il blot per una

proteina come la tubulina o la sinaptofisina per confermare l'uguale carico e

trasferimento delle proteine. Una varietà di fattori sono coinvolti

nell'ottimizzazione della procedura di immunocitochimica e il lettore è

indirizzato a testi più dettagliati (7-9). La paraformalde-ide deve essere