Trasformazione batterica, selezione e screening

DNA cromosomale genomico (mediamente 1,5) abbiamo

invece un numero molto più elevato di DNA plasmidico (fino a

centinaia).

Il fatto che si abbia un controllo più o meno stretto sul numero

 di copie dipende dalle caratteristiche dell’origine di

replicazione del DNA plasmidico tutti i DNA plasmidici che

sono volti al clonaggio (vettori di clonaggio del DNA) sono dei

vettori ad alto numero di copie.

I vettori di espressione di proteine sono invece

 caratterizzati da un minor numero di copie e si replicano nella

cellula molto meno efficacemente la loro funzione è



un’altra contengono elementi che servono per dirigere la

produzione della proteina di interesse. (poche decine di copie

di DNA plasmidico, massimo un centinaio).

Le cellule di E. coli per poter essere trasformate richiedono un

 pre trattamento . Infatti di per se queste cellule non possono

essere trasformate da DNA ambientale perché non posseggono

sulla loro membrana esterna dei macchinari molecolari che

siano adeguati alla internalizzazione del DNA.

Per rendere le cellule di E. coli in grado di essere trasformate

 da DNA ambientale devono essere sottoposte ad un

competenza

procedimento con cui le cellule acquisiscono una

alla trasformazione .

I trattamenti che rendono le cellule competenti hanno due

 funzioni:

1. Ridurre la carica di cui sono dotate le molecole di DNA,

che possiamo considerare dei poli anioni (per la presenza

del gruppo fosfato abbiamo molte cariche negative)

perché l’ostacolo nell’internalizzazione è dato dal fatto

che anche le membrane cellulari sono dotate di cariche

negative.

2. Superare l’assenza di meccanismi molecolari adeguati

per il traporto di DNA .

I procedimenti con cui si rende possibile lo stato di

 competenza in cellule di E. coli sono stati individuati negli anni

CaCl2

70 da Mandel e Higa batteri trattati con soluzioni di

shock termico

(cloruro di calcio) e riscaldati velocemente( ),

potevano essere trasformati con DNA esogeno; quindi questo

trattamento conferiva ai batteri un transiente stato di

“competenza”.

Nel corso degli anni sono stati fatti diversi tentativi per

 migliorare l’efficienza di trasformazione. Le tecniche più

utilizzate oggi sono:

Trasformazione per CaCl2

✓ utilizzo di cationi divalenti



che schermano le cariche negative del DNA.

Elettroporazione

✓ si inducono e si generano dei micro pori



 In entrambi i casi prima si parte da colture di cellule di E.coli

coltivate in condizioni ottimali e si segue la coltura nel corso

della curva di crescita, avendo cura di utilizzare delle cellule

fase di crescita esponenziale.

che si trovano in una

In questa fase le cellule hanno una parete cellulare non spessa

 e sono più frequenti sulla membrana plasmatica dei pori di

discontinuità del doppio strato fosfolipidico attraverso cui si

verifica l’accesso della molecola di DNA nella cellula.

TRASFORMAZIONE CON SALI O DMSO : la procedura è

 facilita se le cellule sono sottoposte ad un breve shock

termico tutta la procedura avviene a 0°C (tenute sempre in

ghiaccio) con l’obiettivo di mantenere la situazione in cui

produco i pori e li lascio permeabili rispetto alle molecole e

poi sottopongo ad uno shock termico il procedimento dura



circa due ore

ELETTROPORAZIONE : si pongono le cellule in un mezzo in

 cui sono presenti degli ioni che si trovano da un lato e

dall’altro della membrana. Le cellule si trovano in un campo

elettrico, tra due piastre (e quindi c’è differenza di potenziale)

e gli ioni per effetto di applicazione del campo elettrico,

pathway ionici

segregano e si creano dei ci vuole



mezz’ora/un’ora

elettroporatore o gene pulser

Struttura di un : si usa una

 sospensione cellulare in cui è presenza il DNA o il farmaco

all’interno di una cuvetta che ha dei lati rivestiti di materiale

metallico che serve per condurre l’impulso che parte da un

alimentatore. Le due piastrine metalliche sono poste a

contatto con la sospensione di cellule.

Per molte specie meno conosciute il metodo chimico non è

 possibile e l’elettroporazione è l’unica alternativa per trasferire

DNA nelle cellule.

Selezione e screening

Bisogna distinguere le cellule che sopravvivono da quelle che

 effettivamente contengono il DNA di interesse si fa un

SELEZIONE E SCREENING

procedimento di che consente di

isolare i trasformanti che hanno le caratterische di interesse,

quelle che hanno internalizzato il gene of interest.

Selezione = necessità dipendente dall’inefficienza della

 reazione di ligasi e di trasformazione batterica e prevenire la

crescita delle non trasformate (senza vettore).

È possibile perché tutti i vettori che utilizzerò contengono

 marcatore di selezione

almeno un gene che codifica per un .

antibiotico

Questo conferisce resistenza ad uno specifico (es:

ampicillina o tetraciclina).

I terreni su cui le cellule vengono fatte crescere a seguito del

 processo di trasformazione sono dei terreni solidi (piastre) che

contengono un terreno ricco adeguato a sostenere una

crescita intensa da parte dei trasformanti ma contengono

anche un antibiotico che deve essere lo stesso indicato nella

mappa del plasmide.

Ciò significa che solo cellule trasformate che contengono il

 gene codificante per la beta-lattamasi (enzima responsabile

della resistenza all’ampicillina), che dipende dall’

internalizzazione del DNA plasmidico, saranno in grado di

sopravvivere nel terreno contenente l’agente di selezione.

Perché questo meccanismo funzioni il ceppo ricevente non

 deve avere di per sé alcuna capacità di sopravvivere a quel

determinato antibiotico.

PS: nelle piastre ogni puntino è una colonia generata dalla

 riproduzione clonale di un singolo trasformante tutte le

cellule di una colonia hanno le stesse caratteristiche.

La selezione non discrimina le cellule batteriche trasformate

 col vettore plasmidico da quelle col vettore contenente

l’inserto genico clonato

Tutti i trasformanti selezionati con il marker di selezione

 screening

contengono il costrutto di interesse? faccio lo



per distinguere le caratteristiche dei cloni.

Uno dei metodi di screening che possiamo usare è la selezione

 operone lac

bianco-blu che si basa sul funzionamento dell’ .

L’operone lac è un sistema di regolazione dell’espressione di

 una sequenza di geni che si trovano sotto il controllo di un

repressorequesto quando si lega nella regione dell’operatore

(che si trova vicino a promotore ovvero la regione in cui si lega

la molecola di RNA polimerasi) non consente la sintesi di geni

definiti geni strutturali.

I geni strutturali hanno a che fare con la sintesi della beta-

 galottosidasi enzima deputato all’idrolisi del lattosio che può



essere utilizzato come fonte di carbonio dalle cellule di E. coli.

È una fonte di C meno preferita rispetto al glucosio se sono

 presenti entrambe le molecole nel terreno di coltura le cellule

di E. coli usano il glucosio.

In presenza di lattosio e in assenza di glucosio, il lattosio

 occupa i siti della molecola del repressore. Quando il lattosio

lega il repressore questo perde la possibilità di interagire con

la regione dell’operatore.

La molecola di RNA polimerasi può legare il promotore ed

 essere attiva nella trascrizione dei 3 geni strutturali. lacZ

codifica per una galottosidasi, lacY per una permeasi (enzima

che consente il trasporto del lattosio nelle cellule) e lacA per

un’ acetil- transferasi (deputata al metabolismo del galattosio).

Questo meccanismo di regolazione dell’operone lac è stato

 utilizzato per mettere appunto dei sistemi di screening.

il vettore pUC contiene il gene lacZ che codifica la beta-

 galattosidasi, in grado di scindere il lattosio nei due

monomeriall’interno di questo gene è presente il polylinker,

in corrispondenza del quale avviene l’inserimento di DNA

esogenose un frammento di DNA viene inserito nella regione

del polylinker il codice di lettura per la beta-galattosidasi viene

interrotto e non può essere prodotta beta-galattosidasi

funzionale.

Se una cellula batterica viene trasformata dal solo plasmide

 pUC (cioè dal vettore non ricombinante), in presenza di un

IPTG

induttore artificiale come l’ (isopropil-tiogalattoside), che

è un analogo del lattosio che però non viene metabolizzato, e

di un substrato cromogeno della beta-galattosidasi, come l’

X-gal , la betagalattosidasi scinde l’X-gal (viene idrolizzato) in

un prodotto colorato precursore dell’indacole colonie

batteriche quindi assumeranno un colore blu.

Se nel gene lacZ del plasmide vettore è stato inserito del DNA

 estraneo, e quindi il vettore è diventato un vettore

ricombinante, le cellule batteriche trasformate non producono

più betagalattosidasi. Pertanto in presenza di IPTG (l’induttore

artificiale dell’operone lac) e di X-gal, quest’ultimo in

mancanza dell’enzima beta-galattosidasi non può essere più

trasformato nel precursore dell’indacole colonie batteriche

quindi, trasformate con un vettore ricombinante, saranno

bianche.

Processo di α-complementazione

Perché tutte le cellule non sono blu dato che anche se lacZ non

 è attivo nel plasmide è presente comunque nel cromosoma

batterico? bisogna manipolare il background genetico delle



cellule.

Si utilizza un ceppo in cui viene alterato il gene wild type

 (1024aa) che codifica per la beta galattosidasi.

I 1024 residui amminoacidici del gene corrispondono ad uno

 solo dei protomeri che entrano nella costituzione della beta

galattosidasi attiva la proteina attiva ha una struttura



quaternaria ed è un tetramero.

Il primo dominio del wild type corrisponde a un dominio di

 tetramerizzazione cioè è direttamente coinvolto nella

formazione del tetramero.

Non è necessario quindi produrre una delezione di tutto il gene

 ma è sufficiente modificare la porzione N terminale del gene

perdendo in questo modo la capacità di tetramerizzare e

rendendo inattiva la beta galattosidasi eliminazione

aminoacidi 11-41 della β-gal produce un enzima NON

FUNZIONANTE

Il batterio selezionato per il clonaggio non sarà wild type, bensì

 mutato di modo da poter produrre una sola subunit&ag