Ricombinazione e trasformazione

La ricombinazione e il trasferimento genico orizzontale

La ricombinazione dimostrò che i segmenti di DNA si possono muovere da una cellula batterica all'altra. Il DNALeiderbergesogeno può essere acquisito dal genoma di un ospite e può conferire all'ospite delle nuove caratteristiche e proprietà (come la capacità di resistere a un certo antibiotico o la capacità di degradare una certa sostanza).

Questo passaggio da un microrganismo all'altro viene chiamato trasferimento genico orizzontale. Si differenzia dal trasferimento genico verticale che riguarda il passaggio di un gene di DNA tra una generazione e l'altra, da una cellula madre a una cellula figlia.

Molte tecniche genetiche usate dai microbiologi si basano su questi meccanismi che avvengono in natura per il trasferimento orizzontale di materiale genetico tra i batteri e sono i meccanismi di: trasformazione, coniugazione, trasduzione e trasposizione. Qualunque e comunque sia il meccanismo di ingresso del DNA nella cellula.

è importante una forma di ricombinazione per consentire che il DNA esogeno venga incorporato. Quando un DNA esogeno entra in una cellula, per essere mantenuto e non degradato dagli enzimi di restrizione deve replicarsi autonomamente o entrare a far parte del DNA cellulare. Se questo non avviene, verrà sicuramente degradato. I cromosomi e i plasmidi si possono replicare autonomamente. I frammenti casuali di DNA esogeno non possono farlo per cui si deve integrare nel DNA cellulare attraverso un meccanismo di ricombinazione. Questo processo prevede la rottura e la ricongiunzione di vari filamenti di DNA. Si pensa si sia evoluto per riparare delle occasionali rotture che si verificano durante la replicazione.

RICOMBINAZIONE OMOLOGA: la ricombinazione omologa viene detta anche cross-over o crossing over. Si verifica quando due segmenti di DNA con sequenze uguali o molto simili si affiancano e si scambiano tra loro alcune porzioni del proprio DNA. Questo meccanismo è stato

studiato per la prima volta in E.coli. Il DNA nudo proveniente dall'esterno entra in una cellula ricevente e si ricombina. Nell'immagine un frammento con il DNA o il cromosoma. Mediante la trasformazione, la cellula ricevente acquisisce il DNA donatore proveniente dall'esterno e il DNA donatore si posiziona vicino al cromosoma batterico con le basi complementari. Avviene la ricombinazione omologa tra il DNA donatore e il DNA ricevente. La parte non ricombinata del DNA donatore viene degradata, mentre il DNA ricevente ha acquisito un nuovo gene. Si ha l'acquisizione di nuove proprietà da parte della cellula ricevente. Una sequenza di geni abcd è omologa alla sequenza di geni presenti sul cromosoma della cellula ricevente. RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA: evento che coinvolge parti di DNA che non presentano delle somiglianze di sequenza. Questo tipo di ricombinazione si osserva in tutti i microrganismi e di solito coinvolge sequenze virali o di DNA specializzato che si.

chiama elemento trasponibile o elementitrasponibili. I batteriofagi temperati possono andare incontro a un ciclo litico (produzione di nuove copie del virus in una cellula ospite infettata) o ciclo lisogenico (il genoma fagico si integra nel cromosoma batterico). L'integrazione avviene grazie a un evento di ricombinazione che avviene a livello di una sequenza specifica di DNA non omologo. È una ricombinazione non omologa detta un sito particolare in cui si va a inserire il plasmide. Gli enzimi prodotti dalla ricombinazione sito-specifica. C'è virus tagliano il DNA dell'ospite e facilitano l'inserzione del DNA virale. Nella ricombinazione omologa c'è una grossa somiglianza tra due sequenze di DNA (due cromosomi diversi). Questi si possono scambiare. La ricombinazione non omologa riguarda sequenze di DNA che non presentano delle somiglianze. Ci sono dei siti di inserzione (es. fago lambda che si inserisce in uno specifico punto all'interno del

1. Trasferimento diretto tra due batteri che vengono temporaneamente a contatto (coniugazione)
2. Trasferimento di un frammento di DNA nudo all'interno di una cellula (trasformazione)
3. Trasporto di DNA batterico da parte dei batteriofagi (trasduzione)
4. Frammenti di DNA che si spostano all'interno del genoma (trasposizione)

TRASFORMAZIONE: tipologia di trasferimento orizzontale di materiale genetico tra batteri in cui frammenti di DNA batterico morta entrano all'interno di una cellula ricevente.

TRASDUZIONE: frammenti di DNA batterico per un errore vengono trasferiti da un batterio all'altro tramite un vettore virale, batteriofago.

CONIUGAZIONE: trasferimento di un plasmide o di una parte di cromosoma tramite un contatto diretto tra le due cellule.

ESPERIMENTO DI GRIFFITH (1928): Ha dimostrato che è possibile un trasferimento di materiale genetico tramite la cromosomabatterico.

trasformazione nei batteri. Haposto le basi per la definizione successiva della natura del materiale genetico.

Colonie traslucide colonie capsulate

Il ceppo S è in grado di provocare la polmonite, mentre il ceppo R non è in grado di provocare la polmonite.

Iniettò dei batteri vivi incapsulati (colonia liscia) nel topo. Il topo muore e da esso fusono isolate diverse coloniedi batteri dotate di capsula (colonie lucide incapsulate) che gli erano state inoculate.

Poi inoculò nel topo dei batteri vivi non incapsulati, derivati dalle colonie ruvide. Il topo non è morto. Dal toposono state isolate poche colonie di batteri non capsulati. I fagociti hanno ucciso la maggior parte di questimicrorganismi poiché non capsulati e più suscettibili alla fagocitosi che non era successo nell’esperimentoprecedente poiché la capsula protegge dalla fagocitosi.

Poi iniettò nel topo dei batteri incapsulati uccisi al calore. Il topo non muore.

Non riuscì a isolare alcuna colonia dal topo perché erano batteri incapsulati ma uccisi. Poi iniettò nel topo dei batteri vivi non capsulati (non patogeno) e dei batteri dotati di capsula uccisi al calore. Il topo muore. Dal topo isolò dei batteri vivi capsulati. C'era qualcosa dai batteri morti capsulati che è stato trasferito nei batteri vivi non capsulati. Questo è stato chiamato ELEMENTO TRASFORMANTE che ha trasformato i batteri vivi non capsulati in batteri vivi capsulati isolati dal topo morto, ovvero la forma patogena che ha ucciso il topo. Questo è stato uno dei primi esperimenti che dimostrò che c'era qualcosa del materiale genetico che poteva essere acquisito dall'esterno e trasformare la cellula.

LA TRASFORMAZIONE

Nella trasformazione il DNA nudo deve integrarsi all'interno del cromosoma dell'ospite, del batterio che riceve, altrimenti viene perso. Quando viene integrato nel cromosoma ospite diventa ereditabile.

ovvero trasferito alla progenie. Alla morte e alla lisi delle cellule si ha il rilascio di DNA che viene frammentato. Altri batteri possono entrare in contatto con questo DNA libero ed integrarlo nella cellula e nel loro cromosoma mediante ricombinazione. La cellula in grado di assorbire il DNA esogeno dall'esterno è detta COMPETENTE (cellula in grado di acquisire DNA esogeno dall'esterno). I batteri possono anche acquisire dei plasmidi (piccole molecole di DNA circolare che si replicano autonomamente; essi rimangono a doppia elica e circolari per potersi replicare), oltre al DNA nudo proveniente dall'ambiente. Ci sono batteri o generi di batteri naturalmente competenti, ovvero acquisiscono DNA nudo dall'esterno e trasformarsi per una caratteristica naturale. Alcuni batteri come E.coli non sono competenti naturali, ma possono essere resi competenti in maniera artificiale, ovvero trattando le cellule con

Un'elevata concentrazione di ioni calcio a basse temperature. Per rendere competente E.coli si prende una provetta Eppendorf, un piccolo volume di sospensione di E.coli, lo si tratta con una soluzione concentrata di cloruro di calcio e lo si mette in un contenitore con del ghiaccio. Sembra che il cloruro di calcio renda le membrane più permeabili al DNA. Per incrementare la frequenza di trasformazione e rendere la reazione in vitro più efficiente si usano concentrazioni di DNA trasformante molto alte, molto superiori rispetto a quelle che normalmente sono presenti in natura. Si usa anche l'elettroporazione per rendere competente E.coli. La trasformazione ha permesso di determinare che il DNA era la molecola dell'ereditarietà grazie agli esperimenti del secolo scorso. La trasformazione è importante poiché applicata a batteri e a lieviti quindi procarioti ed eucarioti per introdurre plasmidi e viene comunemente eseguita nei laboratori di ricerca.

Per studiare i meccanismi biologici alla base o per trasformare una cellula introducendo plasmidi o geni particolari che codificano per una sostanza di interesse industriale. Esperimenti mediante la trasformazione: rendere un ceppo fluorescente grazie all'introduzione di un plasmide tramite trasformazione che contiene il gene per la GFP (green fluorescence protein), proteina verde fluorescente, che rende le cellule fluorescenti sotto la luce UV. Il gene che codifica per la GFP è un gene che deriva da una medusa. Questo gene è stato introdotto all'interno di un plasmide. Questo plasmide è stato usato per trasformare delle cellule, come quelle di E.coli o cellule eucariotiche. Il gene viene poi espresso e si osserva la fluorescenza ai raggi UV. Si può inserire il gene per la GFP in vari tipi cellulari. La GFP viene usata nei laboratori di ricerca.

PROCESSO DELLA TRASFORMAZIONE: competenti hanno dei

recupera il DNA esogeno attraverso un processo di trasformazione. Questo processo avviene grazie alla presenza di recettori specializzati sulla parete batterica che riconoscono e legano il DNA esogeno. Una volta legato, il DNA viene trasferito all'interno della cellula attraverso un canale formato da proteine specializzate presenti nella membrana citoplasmatica. Una volta all'interno della cellula, il DNA esogeno può essere utilizzato come nutrimento o può essere integrato nel cromosoma batterico. Questo processo di trasformazione è un meccanismo di acquisizione di materiale genetico che permette ai batteri di acquisire nuovi geni e aumentare la loro diversità genetica. Nel caso dei batteri Gram positivi, viene prodotto un fattore di competenza che facilita il processo di trasformazione. Il gene responsabile della produzione di questo fattore di competenza viene trascritto e tradotto, e il prodotto finale viene espulso dalla cellula. Successivamente, il DNA esogeno viene recuperato e può essere utilizzato o integrato nel cromosoma batterico.

lega a specifici recettori e induce la sintesi di alt