Trappole ottiche

Le biomolecole sono sistemi micro, quindi seguono regole diverse dei

sistemi macro. Sono nel range dei nm.

Le macchine molecolari trasformano energia idrolizzabile in

lavoro meccanico utile, e hanno un rendimento elevato sull 80% vs

20-30% nel mondo macro.

Hanno un comportamento stocastico, random. Sono sistemi che lavorano

fuori dall equilibrio, il calore viene rilasciato continuamento nell ambiente

es per idrolisi atp. Le forze in gioco osno dell ordine dei pN. L energia

termica è di qualche kbT. Quindi le biomolecole sono sempre soggette

alle fluttuazioni termiche e da qui deriva il loro comportamento

stocastico.

La conformazione delle biomolecole è collegata alla loro funzione

biologica. Le fluttuazioni termiche hanno una funzione centrale per l

attività biologica perché influenzano la forma.

Perché vogliamo registrare eventi prodotti da singole molecole? Gli

esperimenti di bulk registrano il comportamento medio delle

molecole dell insieme. Come immobilizzo e sollecito una singola

molecola?

Un metodo è l AFM: registro le forze, in un range elevato da 50 pN a 10

nN, che sono troppo grandi per i range naturali di pN. Quindi devo

usare trappole ottiche e magnetiche. La trappola ottica ha un range di

forze di 0.1-100 pN, si utilizzano dei fasci laser collimati sulla

particella, che genera un campo di forze di richiamo verso il

centro, si stima la forza. La trappola magnetica funziona in modo

simile ma utilizza un campo magnetico con un magnete verso un

centro, e si riescono a misurare forze ancora +basse quindi 1 fN-1pN. Il

FRET è una tecnica di microscopia, che non misura forze ma gli stati in

cui si trovano le molecole, es tempo di permanenza della molecola

in un certo stato/conformazione.

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). La molecola è

ingegnerizzata in modo che due fluorofori si leghino a due specifici

domini. Basata sull utilizzo di un laser per indurre il passaggio di

energia da un atomo donatore a un accettore. A seconda che

questo passaggio avvenga o meno e che quindi emetta l accettore o il

donatore, si capisce se la molecola è aperta o chiusa quindi il

cambiamento di conformazione. I donatori/accettori hanno la loro

lunghezza d onda di eccitazione e di emissione, che è +bassa di

quella di eccitazione. Se la molecola è aperta il donatore eccitato

emette e lo vedo. Se il donatore e l accettore sono vicini, quindi quando

la molecola è chiusa, allora il donatore passa energia all accettore

e fa emettere l accettore. A seconda della lunghezza d onda emessa

capisco se sta emettendo donatore o accettore e per quanto tempo e

quindi in che conformazione si trova la molecola. La probabilità che

emetta il donatore o l accettore ha una distribuzione a campana con

valor medio centrale pari alla lunghezza d onda di emissione dei due, con

una certa distanza tra i due picchi.

Deltax è la risoluzione spaziale, deltaF è la risoluz della forza. Se

aumento la risoluzione in forza diminuisce quella spaziale. Perché

il loro prodotto è costante e circa pari a 1 kbT. La rigidezza della

sonda (k) è pari al rapporto tra la risoluz di F e la risoluz spaziale.

Trappola ottica o pinza ottica.

Per immobilizzare nello sbazio particelle micro o nano metriche.

Grazie a un fascio di luce laser focalizzato, genera uno spot luminoso

sulla particella applicando una forza. Viene bloccata nel centro

della trappola.

La forza generata dalla trappola è proporzionale allo spostamento

rispetto al centro, come una molla, che richiama verso il centro la

particella in modo elastico. Se una forza esterna porta la particella

fuori dal centro il laser tende a riportarla al centro applicando una forza

opposta. È un dinamometro in grado di misurare forze dell ordine del

pN (0.1-100pN).

Il laser viene focalizzato tramite un obiettivo come nel microscopio.

Lo spot è limitato e molto intenso. Laser + obiettivo + ottiche +

sistema di misura a valle.

Premessa. Keplero nel ‘600 osservò che le comete disponevano la

loro coda dalla parte opposta rispetto al sole, qunidi il sole

esercitava una forza sulla cometa, una pressione radiante sulla

materia celeste. Propose di navigare dalla Terra alla Luna a cavallo della

luce.

I fotoni, anche se non hanno massa, possiedono una quantità di moto

infatti. Quando un atomo assorbe o emette un fotone, la sua quantità di

moto cambia in accordo con la legge di newton. Quando una

microparticella è colpita dalla luce, allora devia la direzione di un

facsio di luce per riflessione o rifrazione e sulla particella agisce

una forza, data dalla variazione della quantità di moto della luce

incidente.

La pressione radiante è stata studiata per usarla per alleggerire il peso

dei raggi e quindi il carburante necessario. La prima trappola ottica è

stata costruita nel 1970 negli USA da Arthur Ashkin, una trappola di

levitazione ovvero ha usato la luce per vincere la forza di gravità.

Il flusso della quantità di moto è dp/dt, la sua variazione segue quella

formula.

W rimane cost perché S è un vettore, che rimane cost in modulo ma

viene deviato per rifrazione qunidi cambia solo direzione di un certo

angolo tetha.

Usando un facsio parallelo avrei una F verso il basso e le componenti

laterali che si annullano, mentre con un facsio collimato genero una

forza verso l alto di propulsione, vs peso e riflessione.

Effetto della rifrazione su particella in polistirene. Lente dell obiettivo.

I due raggi simmetrici vengono deviati due volte, due rifrazioni

(prima dal vuoto alla sfera e poi dalla sfera al vuoto). Si ottiene

una forza verso l alto, verso il centro, che è il fuoco ovvero dove si

incontrano i raggi simmetrici collimati dall obiettivo.

Contro la forza di rifrazione (che va verso l alto = forza di

propulsione), c è la forza peso e la forza di riflessione (che vanno

verso il basso = forza di scattering) che genera una forza di

scattering ovvero verso il basso nella stessa direzione della luce.

Devo vincere forza peso e forza di riflessione. Per amplificare l

effetto della rifrazione, posso agire in diversi modi:

1. aumentare l apertura numerica, ovvero inclino di + i raggi, c è

però un limite fisico, al max si raggiunge 1.4 come apertura numerica

(in olio). E potrei avere poi problemi in detection.

2. aumentare la potenza W, però posso riscaldare e questo non va

bene per le biomolecole, che possono denaturare e modificarsi.

3. Dual beam laser, ovvero due laser proiettati da lati opposti,

collimati con due obiettivi allineati, quindi con due fuochi e due

spot, per elidere le componenti di riflessione. Non ho scattering

grazie al bilanciamento di forze. Ma non è facile avere un setup del

genere, perché devo avere i laser perfettamente allineati e qunidi poi

devo correggere le misure e due lenti una sopra e una sotto qunidi

non un microscopio commerciale. Posso però usare potenze minori

perché ne ho due, quindi trappole +efficienti.

Tutto questo per intrappolare in direzione z ovvero la direzione del

laser. In direzione trasversale? Devo investire la particella con un

fascio luminoso che non sia uniforme ma gaussiano, ovvero con

intensità maggiore al centro e minore ai lati. Sono comunque raggi

simmetrici. Se la particella è spostata verso destra da qualche forza,

allora il raggio C è + intenso rispetto a R per la gaussiana. Si genera una

forza verso il basso, perché quei raggi non sono collimati, ma la

componente in x è maggiore verso sinistra grazie al raggio + intenso.

Con la sovrapposizone degli effetti, sia gaussiana che

collimazione del fascio, devo ottenere una forza sia verso l alto

che verso sinistra/destra. Si crea quindi un campo di forze verso il

centro della trappola. Qualunque forza la porti via dal centro, la

trappola la riporterà nel centro.

Devo misurare lo spostamento della particella. Nel microscopio c è

un obiettivo che collima il raggio e dall altro un condensatore che

accoglie i raggi in uscita e li porta verso un detector ovvero un

fotodiodo a quattro quadranti che misura ddp che correlano con la

posizione.

La miosina sta camminando sull actina tirando la particella. Se aumento

l apertura numerica inclino di + i raggi, sul condensatore i raggi

sono proiettati totalmente e non riesco a vedere lo spostamento

quindi non posso fare detection. Qunidi devo tenere una apertura

numerica limitata.

Hardware. Un laser, attraverso delle ottiche e uno specchio dicroico,

viene deviato verso l obiettivo, che collima verso la particella, raccolti

dal condensatore e poi camera. Obiettivo a immersione a olio per

aumentare l apertura numerica. Detectore di posizione. Lampada

per illuminare.

Qui due laser separati, uno per il trapping e uno per la detection,

disaccoppio.

Calibrazione della trappola. Come faccio a conoscere la rigidezza

della trappola e il fattore di conversione tra ciò che misuro e il

segnale in output?

1. metodo delle forze di trascinamento viscoso. La forza di

trascinamento viscoso è la forza applicata da un fluido di viscosità

eta e velocità v sulla particella sferica di raggio r. Ma io non

conosco la velocità quindi dovrei prima applicare la trappola e misurare

la forza e poi togliere la trappola e misurare la v con cui la pallina si

muove nel flusso di liquido, e confronto la F misurata con la trappola

e la F calcolata con la formula partendo dalla misura di v. Ma è un

metodo impreciso.

2. Allora si intrappola la sferetta, senza avere flusso nella camera. Si

mette in oscillazione la camera con frequenza e ampiezza nota. Il

liquido quindi si mette in movimento con parametri noti. La posizione

della camera la stabilisco io, la velocità è data dalla derivata, la

forza è funzione della velocità. Il fotodiodo misura il segnale d uscita,

che è sempre un coseno ma con un coefficiente A. Si misura il segnale d

uscita a diverse frequenze e plotto i punti e determino A, fitting dei

dati lineare. D è un fattore di calibrazione, non include la rigidezza

della trappola. Metodo preciso di trascinamento delle forze viscose.

3. Metodo dei moti browniani. La sferetta intrappolata è soggetta a

forze casuali dovute alle fluttuazioni termiche, ovvero i moti

browniani. Però sarà sempre richiamata al centro della trappola. Per

definire la rigidezza della trappola e quindi ricavare F come rigidezza *

spostamento. Si parte dall equazione del moto della particella, dato

dal termine inerziale il termine viscoso e il termine elastico e la forza

browniana.

Se F(t) è dato dai moti browniani allora ha media nulla e ha spettro

di potenza costante.

Si fa la trasformata di fourier dell equazione di moto da cui si

ricava la frequen