Terapie rigenerative nelle malattie cardiovascolari ed epatiche

ASPETTI STAMINALI DEL TUMORE EPATICO

Oggi parleremo di staminalità nel tumore epatico. Sicuramente avrete già sentito parlare di staminalità e

tumore in qualche altro corso.

Gli argomenti che andremo a valutare oggi sono i seguenti:

— Il concetto di staminalità tumorale si inserisce in un contesto più ampio, ovvero si parla di ETEROGENEITA’

TUMORALE, quindi in questo contesto si inserisce l’idea della presenza di una popolazione particolare

tumorale con proprietà simili a cellule staminali. Questa sottopopolazione che sono le cancer stem cells,

ovvero cellule staminali con un’implicazione clinica importante e ne capiremo il motivo.

— Valuteremo e capiremo quali sono i metodi utilizzati per

l’isolamento e l’identificazione di questa

sottopopolazione (CSC).

— Scopriremo che cosa sappiamo del tumore epatico in

generale e, nello specifico, analizzeremo il

colangiocarcinoma.

— Vi farò analizzare i dati che produciamo nel nostro

laboratorio riguardo più ad aspetti metabolici di questa

sottopopolazione.

Quando si parla di ETEROGENEITA’ TUMORALE si fa

riferimento a quella situazione in cui il tumore è costituito

da tutta una serie di popolazioni cellulari che si diversificano

per tante proprietà e caratteristiche. Quindi le cellule che

costituiscono la porzione tumorale possono avere delle

differenze nella capacità proliferativa, delle alterazioni

genetiche ed epigenetiche, differenze nella risposta immunitaria, nella senescenza, nel secretoma. Queste

cellule, quindi, produrranno delle citochine e interleuchine,

quindi tutte quelle molecole che regolano sia gli scambi con le

altre porzioni cellulari che anche il potenziale angiogenico.

Se questa è una sezione di un tumore, all’interno co-esistono

delle popolazioni diverse, che avranno proprietà diverse e

queste popolazioni diverse risponderanno in modo diverso alla

terapia.

Il concetto di staminalità tumorale e quindi di CSC prevede che

all’interno del tumore ci sia una sottopopolazione cellulare che

ha delle proprietà simili alle cellule staminali e in particolare la

capacità del self-renewing, ovvero dell’autorinnovamento, ma

anche la capacità di andare a differenziarsi in cellule che

daranno origine alla gran parte della popolazione tumorale. 1

Questo grafico presenta una cellula con proprietà

staminale elevate e man mano che il

differenziamento prosegue, si osserverà la perdita

di questa staminalità.

Questa popolazione di CSC ha anche un’altra

grande caratteristica ovvero ha un alto potenziale

tumorigenico ed un’alta resistenza farmacologica.

Ad oggi il modello delle CSC viene definito plastico,

perché non è fisso e ci sono tutta una serie di fattori

che possono essere intrinseci o estrinseci: quelli

intrinseci sono rappresentati da alterazioni

genetiche ed epigenetiche, mentre quelli estrinseci

sono il microambiente che può andare a modulare e convertire queste cellule più differenziate in cellule con

un potenziale staminale più elevato all’interno del tumore.

Esiste un meccanismo che va a regolare le proprietà staminali ed è il programma EMT (Stemness and

Epithelial to Mesenchymal Transition). Questo è un processo

attivato fisiologicamente nella regolazione dello sviluppo

embrionale e utile per regolare la staminalità delle cellule. Il

meccanismo dell’EMT è associato a delle condizioni

patologiche, nello specifico nel tumore/nel cancro, e va a

regolare dei processi importanti come quello dell’invasione.

L’EMT permette il differenziamento di una cellula che varia il

suo fenotipo da epiteliale a mesenchimale. Il fenotipo

mesenchimale è prolungato e permette l’invasione dei tessuti.

L’EMT quindi regola la formazione di metastasi ma, attraverso

studi successivi, hanno evidenziato che questo meccanismo

molecolare regola la staminalità tumorale e regola anche la

resistenza farmacologica.

L’attivazione di un programma EMT è molto importante per

regolare la staminalità delle cellule tumorali. 2

IMPLICAZIONI TERAPEUTICHE DEL CONCETTO CSCla massa tumorale è molto eterogenea, quindi si hanno

cellule che non sono tumorigeniche, ovvero sono molto differenziate, e ci sono cellule che hanno un

potenziale tumorigenico più elevato, fino ad arrivare alla

componente CSC.

Una terapia convenzionale è in grado di andare ad eliminare tutte

quelle cellule che crescono molto rapidamente e proliferano

rapidamente, ma non è in grado di andare ad interagire e ad

eliminare il fulcro del tumore. Infatti molto spesso ritroviamo, tra

le tipologie di tumore, quella che viene chiamata

recidiva. Idealmente e molto teoricamente, una

terapia specifica per questa sottopopolazione

cellulare va ad eradicare il tumore, perché si va ad

eliminare questa sottopopolazione che la radice del

tumore. Quindi, invece di andare incontro ad un

relapse, idealmente si va incontro ad una remissione

completa del tumore.

Ci sono diverse metodologie per andare ad

identificare e isolare queste cellule nei diversi modelli

tumorali. Quelle più utilizzate sono quattro (il primo è

antigenico e il restante degli approcci sono più

funzionali) e sono:

 APPROCCIO ANTIGENICO

 ALDEFLUOR

 SIDE POPULATION

 SPHERE ASSAY

APPROCCIO ANTIGENICO

Nell’immagine riconosciamo uno studio al

FACS, quindi si ha una sospensione

cellulare mescolata ad un anticorpo

fluorescente. Questa miscela viene fatta

passare nel FACS. Si hanno delle piastre di

detezione che ci fanno separare quelle

cellule che esprimono quell’Ag, perché

quella cellula avrà un determinato Ag che

verrà riconosciuto dall’Ab, che

successivamente si colorerà. Quelle cellule

che non esprimeranno l’Ag non verranno

riconosciute e legate dall’Ab. Si possono

separare due componenti cellulari: una

che esprime l’Ag e una che non lo esprime.

Al FACS, attraverso un dot plot, si può andare ad identificare tutte quelle cellule che esprimono un

determinato marcatore. Il marcatore di staminalità dev’essere noto e, in generale, sono CD133 o il CD44. Se

non ci fosse un marcatore specifico difficilmente si isola una popolazione, perché non si sa quale marcatore

andare ad identificare. 3

ALDEFLUOR

È un’altra tecnologia che fa sempre

uso del FACS e sfrutta la capacità delle

cellule di overesprimere un

particolare enzima che è l’ALDEIDE

DEIDROGENASI (ALDH). Questo

enzima correla molto bene con una

prognosi infausta di diverse tipologie

di tumore (tumore alla postata e alla

mammella) che solitamente sono quei

tumori che esprimono tanto ALDH1 in

pazienti che, quindi, sono in una

condizione più critica ma si è

osservato che c’è una correlazione

importante con la resistenza farmacologica. Infatti, in quei tumori con un’elevata espressione di ALDH1, si ha

un’elevata resistenza farmacologica e rispondono peggio alla terapia farmacologica.

Questa metodologia prevede la presenza di un substrato sintetico per questo enzima e viene chiamato

ALDEFLUOR KIT. Vengono colorate le nostre cellule, fatte passare nel FACS e si identifica un dot plot.

Attraverso un gate andiamo ad analizzare quelle cellule che esprimono quest’enzima, che si coloreranno e

poi si osserveranno quelle cellule che non esprimono il marcatore.

È una metodologia funzionale perché si basa su di un’attività e una funzione specifica delle cellule tumorali.

SIDE POPULATION(SP)

anche in questo caso viene utilizzato il

FACS, ma in questo caso si utilizza un

colorante che è chiamato Hoescht

(33342) e, solitamente, viene utilizzato

in un laboratorio per andare a colorare

i nuclei cellulari e poi analizzarli al

microscopio confocale. Questo

colorante viene utilizzato anche per

questa tecnologia per isolare le cancer

stem cells, ovvero vengono incubate

con il colorante Hoescht e,

successivamente, si va ad analizzare il

tutto al FACS. Quello che si vede è

questa “coda” o “naso” che identifica

quella popolazione posizionata di lato,

nella parte sinistra, in basso del dot

plot. Queste cellule avranno un basso contenuto di Hoescht rispetto alla

totalità in alto, a destra, perché queste cellule sono dotate di un alto contenuto

di trasportatori ABCG.

Se sono caratterizzati da una forte espressione di questi trasportatori, sono in

grado di trasportare fuori, in modo molto più rapido, un farmaco o, in questo

caso, il colorante Hoescht. Se quindi sono colorate di meno, quelle cellule si

troveranno in basso, a sinistra, del dot plot. Quelle cellule che tratterranno più

colorante, risulteranno più colorate e, quindi, è come se trattenessero più

farmaco. In questo modo di vanno ad identificare e diversificare le due

componenti cellulari: una componente più resistente dal punto di vista

farmacologico rispetto alla restante parte del tumore. 4

SPHERE ASSAY

È una tecnologia che si basa

sull’isolamento di cellule

staminali tumorali in

coltura.

L’immagine di sinistra

rappresenta le cellule in

adesione osservabili da

microscopio ottico e sono

un “tappeto”, ovvero

aderiscono alla plastica.

Mentre, se osserviamo

l’immagine di destra, si nota

che le stesse cellule

osservate però in 3D

formano dei corpi sferici. Quindi, tra le due immagini, che cosa si osserva di diverso? Sicuramente la

composizione del terreno, infatti nell’immagine di destra le cellule sono cresciute in un terreno altamente

selettivo, molto simile al terreno utilizzato per far crescere le cellule staminali embrionali. Le cellule

cresceranno in 3D e saranno arricchite dalla componente staminale. Queste saranno cellule con un potenziale

di autorinnovamento. Queste metodologie sono utilizzate in

vitro per andare ad arricchire la

componente staminale e, quindi, per

la capacità di overesprimere

marcatori o la capacità funzionale di

ALDH, la capacità di esprimere dei

trasportatori/pompe ABCG o la

capacità di formare dei copri

sferici/embrionali. Quando, però, si

va a selezionare questa componente,

si deve testare e verificare il

potenziale tumorigenico e quindi si

deve analizzare quelle cellule in grado

di formare dei tumori nel modello in

vivo.

I topi utilizzati sono

immunocompromessi, utili per facilitare l’attecchimento delle cellule umane, altrimenti andremmo incontro

a rigetto.

Questi sono