Tecniche immunochimiche

TECNICHE IMMUNOCHIMICHE

Con le metodiche immunochimiche si sfrutta il legame, più possibilmente

specifico e molto forte, tra ANTIGENE E ANTICORPO!

Con tali metodiche posso andare alla ricerca sia di antigeni sia di anticorpi

presenti nei fluidi biologici.

Posso ricercare un ANTIGENE, che può essere intercettato da un ANTICORPO,

che è quindi il mio strumento di ricerca.

Posso ricercare malattie nel sistema immunitario autoimmuni ad esempio

anticorpi prodotti per qualche motivo in quantità abnorme e anomala; dunque

posso ricercare ANTICORPI, in questo caso lo strumento di ricerca è

l’ANTIGENE.

Se utilizzo come strumento di ricerca gli anticorpi, questi possono essere

monoclonali o policlonali.

Ci sono cinque classi di IMMUNOGLOBULINE (Ig), gamma globuline, quelle

più utilizzate nelle metodiche immunochimiche sono le IgG, le quali sono poi

purificate da un siero di un animale immunizzato, perché comunque si tratta di

una sequenza proteica oppure il siero viene utilizzato tal quale.

Fondamentale nelle metodiche immunochimiche è la formazione

dell’immunocomplesso, spesso associato anche al sistema enzima-substrato,

il tipo di legame che si istaura è non covalente, ma si tratta di forze di

Coulomb, Forze di Van der Waals, legami H, il tipo di legame è intenso.

Quando noi utilizziamo questi strumenti come gli anticorpi parliamo di tecniche

immunochimiche, la specificità delle reazioni antigene-anticorpo non è

sufficiente; All’interno della miscela devo avere il riconoscimento di antigene-

anticorpo (posso ricercare l’antigene con un anticorpo oppure posso ricercare

l’anticorpo nel mio siero con un antigene), per vedere se si è formato

l’immunocomplesso occorre utilizzare marcatori, traccianti che possono

essere enzimi, isotopi, sostanze fluorescenti, i quali vengono combinati per

compiere un dosaggio immunologico.

Gli IMMUNODOSAGGI si dividono in Metodi non marcati e Metodi

marcati

I tipi di reazione che avvengono sono sostanzialmente le stesse e sia

agglutinazione precipitazione

l' che la prevedono la formazione

immunocomplesso

dell' (antigene-anticorpo) infatti è fondamentale che si

formi un polimero ad alto peso molecolare di questo complesso.

-

In particolare, se questa aggregazione avviene:

soluzione acquosa agglutinazione –

in si parla di

matrice solida precipitazione

in si parla di

agglutinazione

Relativamente all' vedremo che può essere:

- diretta antigeni corpuscolati

se ci si avvale di ossia gli antigeni di

interesse sono dati direttamente da cellule o batteri

- indiretta se ci sono dei supporti

adatte condizioni sperimentali adeguati rapporti

È infatti solo in e con

stechiometrici complesso

che si può ottenere l'aggregato, ossia il

antigene-anticorpo.

reazioni di agglutinazione determinazione

Le sono quelle utilizzate per la

del gruppo sanguigno.

test indiretto per la ricerca di anticorpi positivo

Si parla di : si vanno a

comprare sfere in lattice con l'antigene necessario e si vanno a ricercare nel

siero gli anticorpi corrispondenti. Quando le particelle sono legate con

l'antigene, l'agglutinazione indica la presenza di anticorpi.

test indiretto per la ricerca di antigeni positivo

Al contrario si ha il : si ha

la funzionalizzazione non dell'antigene ma degli anticorpi sempre con le sfere

in lattice per la ricerca di antigeni su agenti patogeni.

IMMUNODIFFUSIONE RADIALE SEMPLICE agar o

I gel utilizzati nell'ambito biologico sono tipicamente a base di

agarosio.

A temperatura ambiente infatti sono delle polveri completamente insolubili per

cui bisogna riscaldarle per far sì che, grazie all'elevata temperatura, la

soluzione di agar o agarosio si chiarifichi e diventi limpida. Essa viene fatta poi

raffreddare un po' e, prima che diventi nuovamente solida e si abbia quindi la

polimerizzazione, si funzionalizzano queste matrici e ciò viene fatto in questo

immobilizzare

caso con una soluzione di anticorpo. Così facendo si riesce ad

in maniera omogenea la soluzione di anticorpo all'interno del gel . Poi,

utilizzando solitamente come formine le pipette Pasteur e si vanno a creare

pozzetti di uguale dimensione. A questo punto il nostro sistema di indagine è

dato da un gel con dei pozzetti e un anticorpo omogeneamente distribuito

all'interno dello stesso. determinare la concentrazione incognita di un

Il fine è sostanzialmente

analita in un fluido biologico , in un siero. Mettendo una goccia di siero (circa

diffondere

20 microlitri) all'interno di un pozzetto, esso andrà pian piano a in

tutte le direzioni uniformemente rispetto al pozzetto.

"anello di precipitazione"

Si andrà a formare il cosiddetto ossia si forma un

alone biancastro La

vero e proprio all'interno del gel che invece è trasparente.

formazione di questo anello indica che nel siero è sicuramente presente

l'antigene che è stato infatti riconosciuto dall'anticorpo arrivando così alla

formazione dell'immunocomplesso nello spazio necessario, a seconda della

quantità, per raggiungere la zona di equivalenza.

IMMUNODIFFUSIONE DOPPIA (METODO DI OUCHTERLONY)

Un'altra metodica basata sempre sulla precipitazione dell'immunocomplesso è

sia per sapere se ci sono o meno degli

l'immunodiffusione doppia utilizzata

antigeni ma soprattutto per sapere se antigeni differenti hanno epitopi uguali o

differenti.

A seconda del tipo di linee che vengono fuori, si possono quindi ricavare

diverse informazioni:

- si può sapere se un antigene ha diversi epitopi

- oppure se due antigeni differenti hanno gli stessi epitopi, epitopi differenti o

se c'è un'identità parziale degli stessi.

Se nel gel di agarosio ci sono anticorpi anti-A e due antigeni differenti, l'intento

è quello di capire se ad avere l'epitopo A è sia il primo che il secondo antigene.

Essi verranno quindi caricati in pozzetti adiacenti mentre in un terzo pozzetto

(rosso nell'immagine) verrà caricato l'anticorpo anti-A.

Sono 3 i casi possibili: antigeni entrambi con epitopi A, antigeni con epitopi

completamente differenti e antigeni con un solo epitopo in comune.

IMMUNOELETTROFORESI

reazioni di precipitazione

L'immunoelettroforesi si basa su ed essa unisce la

separazione di proteine (antigeni) mediante elettroforesi con la specificità della

prima

reazione di immunoprecipitazione per cui si fa avvenire

un'elettroforesi e poi una diffusione . Sostanzialmente si ha una miscela

risolvere,

complessa che si cerca di separare, cioè di rendendola più semplice

nei suoi elementi e poi, si può capire se nella miscela in analisi è presente un

determinato antigene, una determinata proteina. A partire dai pozzetti ci sarà

una diffusione e di conseguenza un incontro di antigeni e anticorpi. In

particolare, nel pozzetto grande viene messa la soluzione di anticorpo mentre

le macchie colorate che, dopo essersi separate per via elettroforetica,

cominciano a diffondere nel supporto di gel.

Laddove anche l'anticorpo inizi a diffondere dal pozzetto sino ad incontrare gli

archi di precipitazione

antigeni, nelle zone di equivalenza si formano degli e

in base alla posizione all'intensità di questi ultimi è possibile fare delle indagini

qualitative molto utili soprattutto:

alterato anabolismo delle IgG

nell’ anomalie della sintesi proteica

nello studio delle IMMUNOISTOCHIMICA (IHC)

colorazione dei tessuti

Prevede la con un opportuno enzima generalmente

collegato all'anticorpo e in grado di trasformare il suo substrato in un prodotto

colorato. Sezioni istologiche di tessuti vengono quindi colorate in

corrispondenza dell'antigene scovato dall'anticorpo che, a sua volta, viene

funzionalizzato con un enzima in grado di dare una reazione colorata. Nella

sezione di tessuto in cui avviene il riconoscimento antigene-anticorpo si ha

infatti la precipitazione, proprio in corrispondenza dell'immunocomplesso, del

prodotto colorato e questo ci permette di capire con precisione dov'è

posizionato l'antigene all'interno della sezione del tessuto analizzata.

immunoistochimica sezioni di tessuto,

Di solito con l' si parla di mentre

mmunofluorescenza (IF)

l'i non è strettamente legata ad un tessuto e con

colture cellulari.

essa si può parlare anche semplicemente di

ricercare un antigene utilizzando un anticorpo

Il principio quindi sta nel e

immunoistochimica

per l' possiamo distinguere:

METODO DIRETTO

un se è l'anticorpo che materialmente si lega

anticorpo primario marcato

all'antigene (definito per questo ) ad essere con

il tracciante

METODO INDIRETTO marcato anticorpo

 se ad essere non è l' primario

secondario

ma un che si lega al primario

CITOFLUORIMETRIA (CFM)

È un’altra metodica molto usata anche da istituti come il CROB che usa

appunto le analisi di citofluorimetria per la tipizzazione delle malattie

oncoematologiche e quindi sulle cellule del sangue.

qualitativo e quantitativo

È una tecnica che dà luogo ad un’analisi di tipo

perché permette di stabilire sia quali cioè che tipo di antigeni di superficie proteine

e molecole sono presenti appunto sulla superficie delle cellule analizzate sia

quante sono di quel tipo. cellule sospese

La cosa importante affinchè ciò possa avvenire è avere ossia

pool cellulare sospeso in un fluido

ci deve essere un ed è per questo che è

una tecnica molto usata per le malattie oncoematologiche e quindi applicata

cellule ematiche

sulle che sono sospese nel sangue. Viene applicata anche

tessuti .

sui utilizzo di anticorpi

Anche con questa tecnica il presupposto è l’ infatti la

cellula presenta dei marcatori, quindi degli antigeni di superficie, e abbiamo

prova della loro presenza perché andiamo a farli reagire con l’anticorpo

corrispondente. Gli anticorpi usati in citofluorimetria sono generalmente

monoclonali fluorescenti

analizzare un elevato numero di cellule in breve tempo

Permette di e

valutare

incubando le cellule con una miscela di anticorpi si riescono a

contemporaneamente numerosi parametri di ogni singola cellula.

metodica molto potente

La citofluorimetria quindi è una che permette di

valutare qualsiasi cosa (DNA, organelli intracellulari ecc) per cui, per quanto

richieda l’impiego di strumentazioni molto costose e delicate, i risultati sono

assolutamente