Struttura e funzione dell'insulina

intermolecolare. SINTESI CHIMICA DEI PEPTIDI

La sintesi chimica dei peptidi è eseguita su un supporto solido che viene generalmente chiamato resina,

proprio per il fatto che ha la struttura di una resina. Il primo è stata il polistirene usato da Merrifield, che si

era dato tanto da fare per poter usare un supporto solido per una questione di protezione dei vari gruppi

funzionali, e soprattutto per quanto riguarda le purificazioni: perché per ogni accoppiamento bisognava

purificare per eliminare i reagenti in eccesso e i residui.

Per la formazione del legame peptidico c’è bisogno della condensazione

dei due frammenti (due AA): il gruppo carbossilico deve reagire

specificatamente con il gruppo amminico dell’altro AA e quindi

dobbiamo essere sicuri che gli altri gruppi non reagiscono e che, nel

caso in cui i gruppi R non fossero inerti, questi non diano reazioni

secondarie. La sintesi andrebbe quindi fatta con gruppo carbossilico

protetto (generalmente quando si faceva in soluzione si usava l’estere

metilico), gruppo amminico dell’altro amminoacido protetto, e i gruppi R

uguale; e grazie all’azione di un agente attivante si faceva avvenire

l’accoppiamento. A questo punto bisognava purificare per recuperare il

dipeptide ottenuto e lo si usava come prodotto di partenza per il prossimo accoppiamento.

Innanzitutto bisognava decidere anche in soluzione, in che direzione far procedere la sintesi. Adesso noi

diamo per scontato che proceda dal C all’N terminale nella sintesi dei peptidi, ma questa scelta è stata fatta

perchè altrimenti si potrebbe pensare di proteggere in maniera opposta i gruppi che non devono reagire e

proseguire nell'altro senso. La verità è che si è osservato che la presenza del gruppo carbonilico

dell’ammide, ad una distanza ben precisa dal gruppo che deve reagire, che è quello carbossilico attivato, fa

si che si formi un intermedio ciclico che provoca l’epimerizzazione dell’AA che ha il gruppo carbossilico

attivato. Per cui, se noi attiviamo il peptide per aggiungerci qualcosa in C-terminale, rischiamo di

epimerizzare il peptide stesso che stiamo facendo crescere; invece se proseguiamo in direzione C-N

dovremmo attivare il gruppo carbossilico dell’AA che andiamo ad aggiungere, quindi usandone in eccesso

rovineremmo un po' di amminoacido, ma il peptide che abbiamo sintetizzato resta tal quale e quindi

proteggiamo il nostro prodotto che è molto più prezioso rispetto all’AA singolo. Proprio per questo si è

deciso di fare la sintesi dal C all’N terminale.

GRUPPI PROTETTORI

Per poter evitare e quindi limitare le reazioni secondarie, l’idea, anche in soluzione, era quella di usare un

eccesso di reagenti: questo permetteva di velocizzare la reazione limitando i prodotti secondari e, anche se

la parte in eccesso di AA va ad epimerizzare, ci interessa relativamente perché la scartiamo. La limitazione in

questo caso sta nel fatto che l’uso di un eccesso di reagente va a complicare ancora di più la purificazione,

perché rischiamo di avere dei residui; quindi da questo venne l’idea a Merrifield di attaccare il peptide

crescente su una fase solida. In quel periodo era molto in voga la sintesi ricombinatoriale, che veniva fatta

su supporto solido che permetteva di purificare molto velocemente gli intermedi di reazione, e quindi da

qua venne l’idea a Merrifield di attaccare il prodotto ad una resina.

I gruppi da proteggere sono innanzitutto il gruppo amminico dell’AA aggiunto, e per questo sono stati

sviluppati tutta una serie di gruppi protettori: si potrebbe pensare, innanzitutto, ad una protezione

utilizzando il gruppo acetilico, formando un ammide e abbattendo la reattività dell’ammina. Il problema è

che con un acetilazione (o acilazione), formando l’ammide, otteniamo un prodotto molto stabile che sarà

difficile da riconvertire nell’ammina finale; questo perché il legame che si va a formare sarà molto simile al

peptidico e quindi insieme ad esso verranno rotti, anche parzialmente, gli altri legami peptidici.

Tra i gruppi più usati vi sono:

● Boc = ter-butossi-carbonile

● Fmoc

Questi sono due carbammati che hanno la caratteristica di essere ortogonali tra loro: uno viene deprotetto

in condizioni acide, l’altro in condizioni basiche. Si possono quindi usare in condizioni ortogonali tra loro per

proteggere due gruppi amminici. Infatti,

nella sintesi che si chiama “Fmoc

Based”, quindi basata sull’Fmoc

terbutile, proprio il Boc viene usato per

proteggere le ammine delle lisine. Il

gruppo carbammato si è visto che dà

molto meno questo tipo di reazione

secondaria, e quindi protegge in modo

piuttosto efficace dalla racemeizzazione,

per cui questi due gruppi sono diventati

i favoriti per la sintesi su fase solida.

RESINA DI MERRIFIELD

È fatta di polistirene. Dalla polimerizzazione dello stirene si ottiene la struttura a resina; c’è bisogno poi di un

linker che permetta di recuperare il peptide. La resina non è una sfera solida, si tende a rappresentarla come

un pallino con il peptide che vi cresce sopra; in realtà è

formata da un reticolo, una mesciatura, per cui

all’interno è cavo e il peptide cresce anche dentro alle

sfere di resina. Per cui, quando cresce il peptide, si

hanno due polimeri e non più uno che sono

interconnessi tra di loro: abbiamo un polimero di

polistirene e il nostro peptide.