Riassunto esame Farmaci biotecnologici, Prof. Dalla Via Lisa, libro consigliato Farmaci biotecnologici, Mondin

Farmaci biotecnologici

Differenze tra cellula procariota ed eucariota

Procariota Eucariota

Priva di nucleo Nucleo con membrana selettiva

● ●

DNA circolare libero nel citoplasma DNA nel nucleo sottoforma di cromosoma

● ●

Priva del sistema del Golgi Sistema del Golgi (glicosilazione delle

● ●

Replicazione indiscriminata dal codone di proteine)

● inizio e da quello di stop (sito ORI) Replicazione più complessa:

●

Specificità d’ospite variabile tramite Maturazione dell’mRNA (splicing:

● ○

marcatore eliminazione degli introni)

Fattori R (resistenza ai farmaci e Estremità 3’ con coda poliadeninica

● ○

selettività) Estremità 5’ con cappuccio

○

Sono plasmidi (non essenziali per la Enzimi:

● ○

cellula) DNA polimerasi

■ RNA polimerasi

■ RNA replicasi

■ Trascrittasi inversa

■

Tecnologia del DNA ricombinante consiste nel trasferimento di un gene, che

codifica per una proteina, tramite l’utilizzo di vettori:

Trasformazione: il vettore per il trasporto del gene è un plasmide

● Trasfezione: il vettore per il trasporto del gene è un virus

●

La DNA ligasi lega il gene codificante la mia proteina di interesse, con legami

fosfodiesterici covalenti, nel gene della cellula affinchè possa avvenire trascrizione

e traduzione della proteina.

Uno dei problemi di questa tecnica è riuscire a indirizzare il mio gene nella cellula

senza che esso venga degradato dalle nucleasi.

Insulina

Ormone ipoglicemizzante formato da 2 catene prodotto da cellule Beta delle isole

di Langherans del pancreas a livello del reticolo endoteliale.

1. Pre-proinsulina: formato da peptide segnale (estremità N terminale),

catena A, catena C e catena B (estremità C terminale)

2. Proinsulina: eliminazione del peptide segnale (catena idrofobica)

3. Insulina matura: eliminazione della catena C con formazione di ponti

disolfuro intercatena tra la catena A e B e un ponte disolfuro intracatena

nella A. Questo determina la sua struttura tridimensionale tale da poter

legare i recettori di membrana ed esplicare la sua azione.

L’evoluzione dell’insulina:

1. Insuline convenzionali: preparate tramite una purificazione per

cristallizzazione delle insuline animali di suino e bovino.

2. Insuline a singolo picco: aggiunta di una tappa di purificazione con gel di

filtrazione

3. Insuline estremamente purificate: aggiunta di una ulteriore purificazione

tramite cromatografia a scambio ionico che presentava un quantitativo di

contaminanti inferiori a 10 ppm

4. Insulina a sequenza umana (emp): insulina suina (differenza di un aa)

sottoposta a processo enzimatico con tripsina a pH 7,5 per 45 minuti. Tolti

gli ultimi 8 aminoacidi della catena B e poi preparazione dell’octapeptide in

laboratorio con un’unica differenza nella posizione 30 della catena B che

presentava una treonina al posto di una alanina.

5. Tecnologia DNA ricombinante: minore rischio di immunogenicità,

maggiore riproducibilità, facile produzione, costo minore e

ingegnerizzazione delle insuline con miglioramento della qualità della vita

dei pazienti:

a. Produzione dell’insulina con cellule procariote

b. Produzione dell’insulina con cellule eucariote

i. Insuline ad azione rapida: Lispro, Aspart, Glulisine

ii. Insulina ad azione lenta: Glargine, Detemir, Icodec

Insuline ad azione intermedia: impiega circa 2 ore a fare effetto dopo la

● somministrazione sottocute. Questo succede perché deve avvenire la sua

-3 -8

diluizione da 10 M a 10 M. La sua diluizione nel sottocute implica il

2+

passaggio da una forma aggregata e stabilizzata da uno ione di Zn

(esamero) verso una a trimeri, poi dimeri e infine a monomeri di insulina. La

forma a monomero è fondamentale per il passaggio dell’insulina attraverso

le membrane biologiche per poter esplicare la sua azione. Nella

formulazione dell’insulina intermedia vengono aggiunti dei conservati

fenolici che permettono di tenerla in forma aggregata, a seguito della

somministrazione nel sottocute questi si allontanano, poi si allontana lo

2+ -8

Zn e inizia la diluizione verso la formazione dei monomeri (10 M).

Insuline ad azione rapida: la loro azione si ha dopo circa 30 minuti dalla

● somministrazione, questo perché si è andati ad agire introducendo degli

aminoacidi carichi o ingombranti stericamente affinchè velocizzasse la

formazione dei monomeri nel sottocute evitando la formazione dei dimeri

ma passando direttamente alla formazione dei monomeri. Si è osservato

che gli aminoacidi maggiormente coinvolti nell’aggregazione dell’insulina

sono quelli nella catena B. La concentrazione di insulina da somministrare

-3

rimane sempre la stessa (10 M) poichè si va ad agire sulla velocità di

diluizione.

Lispro: inversione della posizione degli aminoacidi 28 e 29 della

○ catena B. Rispettivamente abbiamo il cambiamento di una prolina in

una lisina nella posizione 28, mentre di una lisina in una prolina in

posizione 29.

Aspart: cambiamento di una prolina con un acido aspartico in

○ posizione 28 della catena B.

Glulisine: cambiamento di una asparagina con una lisina in

○ posizione 3 della catena B e di una lisina in un acido glutammico in

posizione 29 della catena B. La posizione 3 della catena B affianca

degli altri aminoacidi che contribuiscono all’aggregazione ma tale

posizione non è direttamente coinvolta.

Insuline ad azione lenta: la loro azione si ha circa dopo 4 ore dalla

● somministrazione nel sottocute e in questo caso sono state fatte modifiche

aminoacidiche tali da poter aumentare il tempo di diluizione puntando

sull’introduzione di aminoacidi che permettessero la formazione di dimeri

di esameri e che legassero in maniera reversibile le proteine plasmatiche.

Glargine: cambiamento dell’aminoacido in posizione 21 della catena

○ A da una asparagina con una glicina. Ulteriore cambiamento ma non

con una sostituzione ma un’aggiunta di aminoacidi in posizione 31 e

32 della catena B con 2 arginine. Questa modifica porta ad avere un

cambio del punto isoelettrico dell’insulina da 5,4 a 7,0 (pH neutro).

Questo implica che una volta somministrata l’insulina si ritrova a un

pH molto vicino a quello del suo punto isoelettrico, quindi risponde

precipitando e risultando insolubile. Tenderà quindi a formare degli

aggregati che necessitano di tempo per sciogliersi e ridistribuirsi.

Determir: non avvengono sostituzioni aminoacidiche ma si ha la

○ delezione del residuo in posizione 30 della catena B e acilazione del

gruppo NH della lisina in posizione 29. L’acilazione consiste

2

nell’aggiunta di una catena idrofobica (catena di 14 atomi C) che

aumenta il grado di aggregazione dell’insulina e si hanno quindi la

formazione di dimeri di esameri che prolungano ulteriormente

diluizione in monomeri. In particolare questa coda idrofobica

favorisce l’interazione con l’albumina che porta ad un ulteriore

rallentamento dell’effetto dell’insulina.

Icodec: insulina con un’emivita di 168 ore per cui è necessaria una

○ sola somministrazione a settimana. Abbiamo modifiche nella catena

A in posizione 14 di una tirosina che diventa un acido glutammico,

poi nella catena B in posizione 16 di una tirosina con una istidina e in

posizione 25 di una fenilalanina con una istidina. C’è il richiamo alla

detemir con l’eliminazione della posizione 30 e acilazione in

posizione 29 sul gruppo NH della lisina. L’acilazione consiste in

2

un’aggiunta di un mini PEG a basso peso molecolare legato con un

lineker acido -glutammico a un acido icosanedioico (20 C).

γ

L’acilazione implica un legame molto forte ma reversibile con

l'albumina, lenta clearance con il recettore e un aumento di durata

d’azione dell’insulina.

Ormone della crescita - GH

Ormone formato da 191 aminoacidi con 2 ponti disolfuro che delimitano 2 anse

(formati da 2 residui di cisteina) e viene prodotto dalle cellule somatotrope della

adenoipofisi. Identificato il gene per la sua codifica nel cromosoma 17 umano,

isolato poi tramite tecnica del DNA ricombinante.

Ruolo nell’accrescimento:

Osso: proliferazione delle cellule ossee fino alla fusione delle epifisi

● Tessuto adiposo: stimolazione della lipolisi

● Muscolo: stimolazione del trasporto aminoacidico e aumento della sintesi

● di proteine

Fegato: stimolazione della produzione dell’IGF-1 (fattore di crescita simile

● all’insulina)

Aumento della filtrazione glomerulare (osmoregolatorio)

○ Controllo e modulazione dei linfociti

○ Modulazione del ciclo riproduttivo (fertilità)

○ Aumento della sintesi proteica

○ Influenza l’equilibrio tra insulina e glucagone (effetto diabetogeno)

○ influenza gli ormoni tiroidei

○

GH è una proteina non glicosilata di cui esistono diverse isoforme derivanti da

splicing differenti a livello del gene:

85% isoforma 22 kDa

● 5-10% isoforma 20 kDa

● Restante parte di dimeri e oligomeri

●

Formato da 4 regioni organizzate come -eliche di cui le regioni 1 e 4 adibite al

α

legame con il recettore fisiologico. A livello plasmatico troviamo due proteine che

sono un pezzettino extracellulare del recettore, ossia un ectodominio. Questo

circola nel plasma andando a legare e modulare la quantità di GH che andrà nel

recettore vero e proprio. L’ectodominio riconosce entrambe le isoforme con zone

di affinità diverse. É stato visto infatti che l’isoforma da 22 kDa lega i recettori ad

alta affinità, mentre quella da 20 kDa lega entrambe ma preferenzialmente quelli

a bassa affinità. A seguito del legame con l’ectodomio, questo porta GH a verso il

recettore vero e proprio dove avverrà la dimerizzazione del recettore con sua

conseguente attivazione e trasmissione del segnale nella cellula.

L’evoluzione di GH:

1. Preparazioni animali: GH ottenuto da cellule somatotrope di animali

(morbo della mucca pazza)

2. Preparazioni con E. Coli:

a. Estrazione di tutto mRNA seguito da purificazione per ottenere

mRNA maturo (poichè E. Coli non effettua glicosilazione).

b. Introduzione poi di un codone per la metionina all'estremità

N-terminale affinchè E. Coli riconosca la proteina come propria.

c. Utilizzo della trascrittasi inversa per ottenere il cDNA e

successivamente inserito in un vettore (pBR322) che ha come ospite

E. Coli, che dopo l’espressione del gene, produrrà GH ricombinante

(192 aa) ed estratto tramite lisi della cellula.

3. Miglioramento della procedura precedente:

a. Aggiunta di una tripletta di metionina - alanina - acido glutammico

poichè si sapeva che E. Coli effettuava un taglio proteolitico se era

presente una metionina vicino ad una alanina.

b. Preparazione del DNA ricombinante, inserito nel vettore e portato in

E. Coli con conseguente produzione di GH con un dipeptide in più

all’estremità N-terminale (193 aa)

c. Lisi del batterio e rimozione del dipeptide in laboratorio da GH

4. Risoluzione del problema dell’immunogenicità:

a. Nell’isolare l’mRNA maturo di GH si lascia il peptide segnale

attaccato (catena idrofobica)

b. Il peptide segnale si va ad infilare nelle membrane di E. Coli

permettendo il rilascio del mio ormone GH a livello dello spazio

periplasmatico (spazio tra membrana e parete)

c. Shock osmotico per rompere la parete di E. Coli senza andare a

compromettere l’integrità della membrana evitando la formazione di

contaminanti immunogenici

5. Preparazione in cellula eucariote (line tumorale mammaria di topo C127)

a. Struttura pseudogenomica: hanno preso un minigene con tutti gli

esoni e introni di GH (mRNA e DNA genomico) associato poi a un

promotore (fondamentale per dare il via a trascrizione e traduzione

dei geni). Il promotore utilizzato è di tipo inducibile delle MT (metallo

tioneine: proteine ricche in cisteine che vanno a detossificare i

metalli pesanti e per regolare l’omeostasi dei metalli bivalenti)

b. Vettore ibrido: combinazione di un plasmide e di un pezzo di virus

del papilloma bovino (69% virale) affinchè sia in grado di infettare

una cellula eucariota tramite trasfezione

c. Inserimento della struttura pseudogenomica nel vettore ibrido per

poter infettare la cellula C127, questo ha consentito la produzione di

GH in grandi quantità

i. Applicazione industriale: viene attuata questa tecnica

ricombinante su scala industriale tramite il sistema delle

bottiglie rotanti in cui è possibile raccogliere grandi quantità

di GH. Le cellule vanno in adesione della superficie delle

bottiglie che vengono continuamente bagnate dal mezzo di

coltura, si raccoglie il liquido ogni x giorni da cui si estrae GH.

Utilizzo di GH in terapia:

Nanismo: pazienti deficienti in GH in cui non c’è l’allungamento di arti

● superiori e inferiori

Bassa statura idiopatica: pazienti pediatrici con deficienza parziale di GH

● dovuta a problemi di trasmissione del segnale per carenza di recettori,

affinità ridotta o compromissione del segnale dopo la dimerizzazione.

Sindrome di Turner: pazienti affetti da malattia genetica non ereditaria il

● cui genotipo è 2n - 1 e X0, ossia la mancanza di un cromosoma a livello dei

cromosomi sessuali, tali pazienti sono fenotipicamente femminili e

presentano problemi cardiaci, problemi uditivi e bassa statura.

Insufficienza renale cronica: stimolo generalizzato del metabolismo

● Adulti senza ipofisi a causa di tumore ipofisario

● Adulti ultra-sessantenni con carenza di GH: una riduzione negli anziani di

● Gh è fisiologica ma se eccessiva porta diminuzione di tessuto muscolare e

aumento di tessuto adiposo predisponendo all’obesità e malattie

cardiovascolari

Allattamento: negli animali permette una produzione di latte materno con

● maggiore componente lipidica ma non è stata osservata la stessa

caratteristica nelle donne

Obesità: si era ipotizzato di utilizzare il GH come stimolante della lipolisi ma

● non videro nessun effetto significativo

Ustioni severe (50% del corpo): una somministrazione di GH porta a uno

● stimolo di trasporto di aminoacidi nel muscolo e sintesi proteica tale da

controbilanciare la “stress response” che invece porta a una demolizione

aminoacidica negli ustionati gravi impedendo la cicatrizzazione e facendo

rigettare gli impianti autologhi.

Dose: 0,025 - 0,035 mg/kg/die per via sc

Effetti avversi:

Pediatrici:

● Effetto antidiuretico con comparsa di ipertensione intracranica

○ Intolleranza al glucosio con aumento di glicogeno lisi e di lipolisi

○ Raccomandazione: non somministrare a pazienti che hanno

○ completato la terapia antitumorale da non meno di 1 anno

Adulti:

● Ritenzione idrica con conseguente aumento di peso

○ Gonfiore delle atricolazione con artralgia

○ Sindrome del tunnel carpale

○

Usi illeciti: GH ricombinante viene utilizzato dagli atleti in modo illecito poichè

stimola l’anabolismo ed è difficile da identificare poichè sono molecole

fisiologiche. Quindi si va a verificare il rapporto presente tra le due isoforme di 22

kDa e 20 kDa, se cambia di molto allora ne è stato fatto un uso illecito.

Citochine

Proteine glicosilate prodotte tramite tecnologia del DNA ricombinante.

Comprendono interleuchine ed interferoni e mediano la comunicazione tra le

cellule del sistema immunitario, sistema ematico e del sistema nervoso.

Non sono assimilabili agli ormoni:

Citochine Ormoni

Produzione ed espressione da numerose Prodotti da cellule specifiche

● ●

tipologie di cellule Effetto endocrino (lontano)

●

Effetto autocrino (locale) Effetto di lunga durata

● ●

Effetto di breve durata autolimitante

● Le citochine possono essere prodotte da molte cellule ma anche un tipo di cellula

può produrre vari tipi di citochine.

Funzioni delle citochine:

Regolatoria: sono dei sistemi di comunicazione molto potenti, tali da

● necessitare concentrazioni nanomolari o picomolari

Inducibili: una cellula produce una citochina a seguito di una

○ stimolo da parte di un agente infettivo, tossico o di un danno

tissutale

Costitutive: immagazzinate in granuli intracellulari citoplasmatici

○ pronte per essere secrete al momento del bisogno

Fattori di crescita: hanno un ruolo regolatorio anche al di fuori

○ dell’infiammazione (NGF e BDNF)

Ridondanti: più di una citochina ha la stessa funzione

● Pleiotropiche: possono avere uno stesso effetto fisiologico in diversi tipi di

● cellule ma possono anche avere un effetto diverso su diverse cellule

Interleuchine

Citochine che mediano la comunicazione tra globuli bianchi, sono una famiglia di

circa 30 sottotipi. Il riconoscimento di una interleuchina dal suo recettore porta

alla variazione di uno stato fosforilativo di alcune proteine come:

Tirosina: intervento su tirosin chinasi

● Residui serinici o treoninici: intervento su chinasi ser-treo

● 2+

Secondo messaggero: aumenta il la concentrazione di Ca a livello

● citosolico

Idrolisi di fosfatidiletanolammina presente sulla membrana plasmatica a

● seguito dell’attivazione del recettore (2° messaggero): determina la

produzione di diacilglicerolo

Prodotti ad uso farmaceutico derivanti dalla tecnologia del DNA ricombinante:

Kineret (IL-1): questo prodotto non è l’interleuchina in sè ma è l’antagonista

● di IL-1. Si osservò che l’IL-1 aveva azione pro-infiammatoria nell’artrite

reumatoide, condizione patologica di continua di infiammazione. Kineret

nasce con l’idea di andare a reprimere questo effetto infiammatorio.

Modi di repressione della sintomatologia causata da IL-1:

1. Antagonista solubile del recettore: preparazione di un pezzo di

recettore (solubile) che catturasse il ligando e impedisse il legame

completo con il recettore

2. Antagonista del ligando: molecola simile al ligando che lega una

delle 2 subunità del recettore che, per ingombro sterico o presenza

di cariche, non dimerizza e non trasmette il segnale.

3. Anticorpi monoclonali:

a. Riconoscimento del ligando con la sua cattura

b. Riconoscimento del recettore con legame al posto del ligando

Si è seguita quindi l’idea di creare un antagonista del recettore affinchè il

riconoscimento di Kineret da parte del recettore non porti ad alcuna

risposta infiammatoria. Questo perchè fisiologicamente esiste l’antagonista

di IL-1: Persone sane: prevalenza di antagonista di IL-1 con conseguente

○ stato di riposo

Persone malate: prevalenza di IL-1 con conseguente stato

○ infiammatorio

Dose: 100 mg/die per via sc in associazione con metotressato

■

Proleukin (IL-2): prodotto nato per il trattamento del carcinoma renale,

● non è esattamente il prodotto fisiologico poichè non è glicosilata (prodotta

in E. Coli), vede una sostituzione in posizione 125 di una cisteina con una

serina e la rimozione di una alanina all’estremità N-terminale. IL-2 viene

prodotta dai linfociti T ed esplica la sua azione autocrina su di essi

stimolandone la proliferazione e differenziamento. Agisce anche sulle

cellule B per aumentare la produzione di anticorpi, stimola le cellule natural

killer e i monociti dando un complessivo effetto immunostimolatorio.

I linfociti T:

Non stimolati: espressione del recettore per IL-2 formato da 2

○ subunità: (CD122) e (CD132). Questo recettore ha una bassa affinità

β γ

per il ligando e quindi non stimola proliferazione e differenziazione.

Stimolati: espressione del recettore per IL-2 formato da 3 subunità: ,

○ β

e (CD25). L’avvicinamento della subunità determina la

γ α α

trimerizzazione del recettore costituendo un recettore

estremamente affine all’IL-2

L’applicazione di Proleukin consiste quindi di sfruttare la stimolazione del

sistema immunitario in un paziente affetto da carcinoma renale per avere

una risposta più efficiente. La terapia prevede un’unica somministrazione di

un’alta dose (600.000 unità). Effetti collaterali: aumento di permeabilità

capillare che causa ipotensione, ridotta perfusione d’organo con

conseguente compromissione renale

Denileukin diftitox: proteina di fusione che vede la fusione di IL-2

○ 1 133 1 387

(Ala -Thr ) con una parte di tossina difterica (Met -Thr ). Della

tossina difterica sono stati tenuti 2 domini dei 3:

Dominio enzimaticamente attivo: manifesta l’attività tossica

■ Dominio vicinale: di traslocazione della parte tossica

■ Dominio B: di binding che riconosce la cellula e fa sì che la

■ tossina la uccida (eliminato)

Le proteine di fusione nascono con l’idea di:

Ridurre il riconoscimento della proteina terapeutica e la sua

■ degradazione

Semplificare la purificazione tramite colonne cromatografiche

■ (riconosciute sequenze specifiche)

Ottenere una duplice attività

■

Denileukin diftitox ha come target il linfoma cutaneo di tipo T

caratterizzate da cellule tumorali che sovraesprimono CD25. Il

farmaco riconosce CD25 sovraespresso dalle cellule tumorali con la la

parte di IL-2 , si ha la formazione di una vescicola endocitica in cui si

abbassa il pH, questo determina la liberazione della parte di tossina

difterica permettendo un’azione citotossica. Farmaco prodotto nel

2008 ma ritirato nel 2014 per problemi di formulazione e produzione.

Riapprovato nel 2021 in Giappone per il trattamento di 2 tipologie di

linfoma cutaneo. Effetti collaterali: reazioni fatali al momento

dell’infusione per cui necessaria la somministrazione in strutture

ospedaliere, sindrome di permeabilità capillare con mancata

perfusione d’organo e problemi visivi.

Neumega (IL-11): prodotto ricombinante che ha lo scopo di prevenire la

● trombocitopenia (deplezione di pst nel sangue dovute a chemioterapia). Il

prodotto ricombinante agisce come l’IL-11 che ha funzione

antinfiammatoria bloccando sui macrofagi la produzione di IL-1 e funzione

di interferone . Promuove la proliferazione cellulare di linfociti T e B,

γ

mantiene il tessuto connettivo con l’aumento di produzione di collagene e

stimola la produzione di cellule emopoi