Riassunto esame Biochimica, Prof. Campanini Barbara, libro consigliato I principi di biochimica di Lehninger , Nelson, Cox

CATALISI COVALENTE

Si tratta di una catalisi non molto frequente, ma nel caso degli enzimi, possono comunque formarsi

intermedi covalenti. Si va a formare un addotto covalente tra substrato ed enzima, che viene sfruttato da

enzimi che catalizzano reazioni di scissione di legami, come l’idrolisi o rottura legami C-C.

Quasi sempre un residuo nucleofilo del sito attivo, forma un legame con un atomo elettrofilo del substrato.

- Nucleofili possono essere: gruppi OH deprotonati, gruppi tiolici deprotonati, carbanioni, azoti oppure la

catena laterale dell’istidina

- Elettrofili possono essere: C carbonilici, C impegnati in legami di tipo imminici o gruppi fosfato

47

GAIA FEROLDI UNIPR 2023-2024

MECCANISMI CATALITICI DEGLI ENZIMI

Gli enzimi sono classificati in base alla reazione che catalizzano, dall’EC number.

Il numero EC possiede 4 cifre separate da punti: il primo numero indica la classe principale mentre gli altri

dettagliano sempre più il tipo di reazione catalizzata.

L’esochinasi per esempio ha un EC=2.7.1.1

→ il numero 2 indica la transferasi (ovvero reazione di trasferimento di un gruppo, che in questo caso è il

gruppo fosfato)

→ il numero 7 indica invece il gruppo fosfato, ovvero il gruppo trasferito

→ il numero 1 è il gruppo accettore a cui viene trasferito il gruppo, in questo caso OH

→ l’altro numero 1 indica il glucosio, ovvero il substrato su cui l’esochinasi lavora. Si tratta di un numero è

importante perché per esempio nell’esochinasi esistono 177 diversi substrati su cui può agire.

Tutti gli enzimi ad oggi classificati sono inseriti in un database chiamato Brenda.

Tutte le attività enzimatiche sono classificabili in 6 classi:

1) OSSIDOREDUTTASI: catalizzatori di ossidoriduzioni, ovvero trasferimento di elettroni (come l’etanolo

ossidato ad acetaldeide)

2) TRAFERASI: enzimi che catalizzano trasferimento di gruppi (come l’esochinasi che catalizza il

trasferimento del fosfato all’OH del glucosio)

3) IDROLASI: enzimi che catalizzano reazione idrolitiche, in cui l’acqua rompe un legame covalente (come

l’idrolisi del legame peptidico)

4) LIASI: enzimi che catalizzano reazioni di rottura legami C-C / C-N /C-S , ovviamente non idrolitiche

altrimenti sarebbero enzimi idrolasi (come la decarbossilazione del piruvato per dare acetaldeide)

5) ISOMERASI: enzimi che catalizzano reazione di isomerizzazione (come maleato e fumarato)

6) LIGASI, catalizzano formazione di legami covalenti dipendenti da ATP (formazione dell’ ossalacetato a

partire dal piruvato)

In realtà esistono anche le traslocasi (classe 7) ovvero proteine di membrana che facilitano il passaggio di

molecole attraverso la membrana.

Sono state recentemente classificate insieme agli enzimi per analogie funzionali.

48

GAIA FEROLDI UNIPR 2023-2024

PROTEASI

Le proteasi sono chiamate anche “peptidasi” e sono enzimi con importantissime funzione biologiche.

Si trovano nel processo di digestione, perché permettono l’assorbimento di amminoacidi, si trovano nella

cascata di coagulazione e anche nell’attivazione di enzimi e ormoni.

Le proteasi vanno ad idrolizzare il legame peptidico, portando alla formazione di due frammenti a partire

dal polipeptide. Si chiama anche reazione di proteolisi.

Si tratta di una reazione spontanea ma lentissima in condizioni fisiologiche, perché il legame peptidico ha

parziale carattere di doppio legame quindi la probabilità che si rompa è bassa (legame difficile da rompere)

e oltretutto l’acqua è un pessimo nucleofilo.

Gli enzimi che catalizzano l’idrolisi del legame peptidico sono tutti accumunati da strategie che rendono o

l’acqua più nucleofila o tendono a rendere il C carbonilico più elettrofilo.

Le principali proteasi sono classificate sulla base del meccanismo:

- serina-proteasi, hanno nel sito attivo un residuo di serina

- cisteina-proteasi, hanno nel sito attivo un residuo di cisteina

- aspartico-proteasi

- metallo-proteasi

La reazione di idrolisi nella serina/cisteina-proteasi viene divisa in due passaggi:

1) attacco al C del legame peptidico da parte della cisteina/serina (miglior nucleofili rispetto all’acqua)

2) si forma un intermedio che viene idrolizzato.

L’attacco dell’acqua non è diretto ma preceduto dall’attacco di serina/cisteina.

Nel caso dell’idrolisi dell’aspartico e metallo-

proteasi invece, l’acqua è resa un miglior nucleofilo perché viene deprotonata da basi (aspartato

nell’aspartico e metalli nella metallo-proteasi).

I metalli poi polarizzano l’acqua favorendo la deprotonazione dell’acqua ancora di più.

49

GAIA FEROLDI UNIPR 2023-2024

Le proteasi hanno substrato macromolecolare, ovvero il polipeptide.

Il substrato si lega in modo abbastanza superficiale e non in modo profondo, a causa delle sue dimensioni.

Il polipeptide si lega e la catene laterali degli amminoacidi fanno interazioni con i residui del sito attivo.

Il peptide si lega completamente denaturato e destrutturato, e viene riconosciuto dai residui del sito attivo

(proteasi specifiche per il peptide), in modo da impedire che la proteasi possa idrolizzare altre proteine.

PROTEASI DIGESTIVE

Le proteasi digestive sono prodotte da stomaco o pancreas, in forma sempre INATTIVA.

Vengono poi attivate in seguito a stimoli differenti, in un certo momento e in un certo luogo, in modo da

controllarne perfettamente l’attività.

Questi precursori inattivi delle proteasi sono chiamati ZIMOGENI.

Nello stomaco viene secreto il PEPSINOGENO, precursore inattivo della proteasi PEPSINA.

La presenza di cibo nello stomaco stimola la produzione di HCl e pepsinogeno, il quale si attiva tramite un

meccanismo autocatalitico. L’HCl prodotto funge da antibatterico ma è in grado anche di denaturare

proteine, per renderle successibili alla proteolisi.

Il cibo arriva poi nell’intestino, dove la pepsina viene inattivata perché trova un ambiente basico.

Nell’intestino troviamo però proteasi pancreatiche, prodotte dal pancreas e riversate qui:

-CHIMOTRIPSINA (zimogeno=CHIMOTRIPISNOGENO)

- TRIPSINA (zimogeno= TRIPSINOGENO)

- ELASTASI (zimogeno=PROELASTASI)

- CARBOSSIPEPSILASI (zimogeno=PROCARBOSSIPEPSILASI)

Esistono diverse proteasi perché la loro presenza garantisce che riescano a riconoscere e proteolizzare

qualsiasi tipo di polipeptide. 50

GAIA FEROLDI UNIPR 2023-2024

Le proteasi si attivano per proteolisi e si attivano con un meccanismo a “cascata”, nel senso che una

proteasi attivata, ne attiva altre. La prima proteasi che deve essere attivata

è la tripsina la (da tripsinogeno a

tripsina).

La conversione da tripsinogeno a tripsina

è proteolitica, nel senso che viene tagliata

una parte del tripsinogeno tramite un

enzima chiamato enteropeptidasi, ovvero

una proteasi di membrana che si trova

legata alle cellule dell’intestino, gli

enterociti.

Il tripsinogeno prodotto dal pancreas si attiva solo quando arriva all’intestino dove trova l’enteropeptidasi

legata alle cellule intestinale.

Il tripsinogeno viene convertito in tripsina, la quale è in grado di autotagliarsi e quindi continuare ad

attivarsi (attivazione autocatalitica, la tripsina si autodigerisce).

La tripsina ora può attivare tutte le altre protasi digestive: attiva il chimotripsinogeno in chimotripsina, il

procarbossipeptidasi in carbossipeptidasi e infine la proelastasi in elastasi.

In realtà il chimotripsinogeno subisce due tagli proteolitici, uno ad opera dalla tripsina e uno autocatalitico.

L’attivazione quindi avviene nell’intestino per permettere tutta l’attivazione a cascata lì.

Quando il chimotripsinogeno viene attivato dalla tripsina, viene

tagliato un legame peptidico. La chimotripsina attivata a questo

punto si autotaglia e va a rimuovere ulteriori peptidi.

Quindi da un polipeptide si ottengono 3 frammenti, i quali sono

tenuti uniti da ponti di solfuro che impediscono di separarli.

Quando tagliamo il peptide, avviene è un cambio

conformazionale, che porta alla conformazione attiva. Quando

la proteasi inattiva viene proteolizzata si ha formazione del sito

attivo; quando la proteasi è inattiva non possiede proprio il sito

attivo e quindi potenzialmente non può legare alcun substrato.

51

GAIA FEROLDI UNIPR 2023-2024

La proteolisi quindi può essere considerata una modificazione post traduzionale perché va ad alterare le

proprietà chimiche della proteina.

Le proteasi sono specifiche e proteolizzano solo quel substrato specifico.

Il sito attivo è in grado di riconoscere la catena laterale degli amminoacidici vicino al legame che verrà poi

tagliato. Il riconoscimento solitamente avviene a monte o a valle, ma può avvenire anche lungo la catena.

Spesso la specificità è per gruppo non per singolo atomo: per esempio la tripsina (tasca con cariche

negative) può accogliere solo residui carichi + come la lisina, la chimotripsina (con tasca grande e idrofobica)

può accogliere residui grandi e idrofobici, l’elastasi (tasca piccola) accoglie invece residui poco

ingombranti…

Alcune proteasi riconoscono gruppi con caratteristiche chimico-fisiche simili, altre riconoscono in modo più

specifico un singolo amminoacido (in base alle proprietà chimico-fisiche della tasca vicino al taglio).

SPECIFICITA’ DELLE PROTEINE DIGESTIVE

La specificità di chimotripsina, tripsina ed elastasi è determinata dalla natura chimica della catena laterale

dell’aminoacido che partecipa, col suo gruppo carbossilico, alla formazione del legame peptidico. In

particolare, nel sito attivo delle tre proteasi si deve posizionare con la corretta orientazione il legame

peptidico che deve subire rottura idrolitica. Nel sito attivo è anche presente una cavità di legame, con

diverse caratteristiche per le tre proteasi, che è in grado di legare preferenzialmente una catena laterale

amminoacidica grande e apolare, come nel caso della chimotripsina, o carica positivamente, come nel caso

della tripsina, o di piccole dimensioni, come nel caso della elastasi.

52

GAIA FEROLDI UNIPR 2023-2024

MECCANISMO CATALITICO DELLA CHIMOTRIPSINA (SERINA-PROTEASI DIGESTIVA)

Le serina-proteasi e in generale tutte

le serina-idrolasi (quindi enzimi che

catalizzano reazioni di idrolisi di

legami ammidici o esterei) sono

caratterizzati dalla TRIADE

CATALITICA, ovvero 3 residui

amminoacidici lontani nella sequenza

ma vicini nel sito attivo dell’enzima una volta attivato (in particolare si trovano vicini dopo il processo di

proteolisi (taglio)).

Questi 3 residui sono aspartato, istidina e serina.

Il residuo catalitico vero e proprio, ovvero la serina, da un attacco nucleofilo al carbonio carbonilico del

leg