Processo dal DNA all'RNA

Introduzione e RNA

La trascrizione è quel processo per cui la sequenza nucleotidica del filamento stampo o templato del DNA viene letta e trascritta in un filamento complementare a RNA. L’RNA trasferisce poi le informazioni presenti sul DNA all’apparato di traduzione, per dirigere la sintesi proteica, che avviene grazie ai ribosomi. La trascrizione avviene durante tutta la vita della cellula, soprattutto durante l’interfase, quindi contemporaneamente alla sintesi di DNA, durante la fase S, nel nucleo.

Nel caso in cui una forcella di replicazione dovesse incontrare una RNA polimerasi che sta trascrivendo quel tratto, è la RNA polimerasi a staccarsi, anche se si mantiene comunque attaccata in qualche modo per continuare la trascrizione una volta passata la forcella di replicazione.

Nel nucleo, il DNA è organizzato in cromatina, la cui conformazione è modificabile da fattori che la aprono per far intervenire delle proteine (rimodellatori della cromatina), che espongono la regione dei promotori per permettere che siano riconosciuti dalla RNA polimerasi. A valle della RNA polimerasi la cromatina si disfa, rendendo leggibile il DNA, e dopo il passaggio di questa la cromatina si ricompatta riassumendo subito la sua struttura.

Sia la duplicazione che la trascrizione sono processi durante i quali solo i piccoli tratti che devono essere copiati (e non grandi parti di genoma) sono scoperti. Poiché i tratti sono copiati da grandi complessi proteici, anche se sono liberi dalle proteine istoniche, sono comunque in qualche modo protetti da altre proteine.

L’enzima che agisce è una RNA polimerasi, che, senza la necessità di un primer, sintetizzando ex-novo, permette l’appaiamento guanina-citosina e adenina-uracile. Tale polimerasi è in grado di sintetizzare solo in direzione 5’-3’, leggendo un filamento stampo, che è antiparallelo (direzione 3’-5’). Per fare ciò deve poter individuare il filamento da copiare (filamento antisenso o stampo) e distinguerlo dall’altro filamento di DNA (filamento senso o codificante).

Sui cromosomi i diversi geni da trascrivere possono essere posizionati su ambo i filamenti di DNA, perciò, la polimerasi capisce la direzione del filamento da trascrivere per primo attraverso la lettura della direzione, che deve essere 5’-3’, e la presenza di segnali che indicano i siti d’inizio e di termine della trascrizione. Il gene è l’unità informazionale del DNA, costituita da una regione che contiene l’informazione per codificare una data proteina, una regione a monte al 5’ dove sono presenti dei segnali di inizio e, una regione al 3’ in cui sono presenti dei segnali di terminazione, che permettono il distacco della RNA polimerasi, che altrimenti continuerebbe la trascrizione all’infinito.

Principali RNA trascritti

• RNA messaggeri (mRNA), trascritti che devono essere ulteriormente codificati attraverso la traduzione
• RNA ribosomiali (rRNA), trascritto strutturale
• RNA di trasporto (tRNA), trascritto strutturale
• RNA minori scoperti in tempi recenti delle quali si stanno ancora studiando le funzioni

Fase di inizio

Il segnale di inizio, detto promotore, è una sequenza di DNA più o meno complessa che permette l’interazione corretta tra filamento stampo e RNA polimerasi, attirando quest’ultima a sé, posizionandola in modo corretto e facendo in modo che la sua attività catalitica sia pronta a leggere quello che viene definito il nucleotide +1, ovvero il punto di inizio dell'informazione della trascrizione.

In generale la numerazione dei nucleotidi dei geni viene identificata in termini positivi dal primo nucleotide che viene trascritto, e in termini negativi a monte del nucleotide +1. Le sequenze principali in un promotore procariotico, che contengono le informazioni per legare l’RNA polimerasi, sono le:

• -10, la sequenza -10 è rappresentata dalle basi TATAAT, sequenza AT rich, facilmente denaturabili, chiamata TATA box.
• -35, la sequenza -35 è rappresentata dalle basi TTGACA.

Il sito di attacco della RNA polimerasi è sul filamento stampo o codificante. Copiando il filamento stampo, che è Watson, ottengo Crick RNA.

Grazie all'intervento di una serie di proteine che riconoscono le sequenze -10 e -35 si ha una parziale denaturazione della doppia elica, attraverso la rottura dei legami a idrogeno ad opera della RNA polimerasi. Nei procarioti è presente solo una polimerasi per tutti gli RNA. L’RNA polimerasi è costituita da un enzima core, nel quale è presente sia una tasca d’ingresso dalla quale passa la molecola di DNA per subire la denaturazione, sia una regione in cui la molecola di DNA viene rinaturata. L’enzima è composto da:

• Sito di ingresso per i ribonucleosidi trifosfati, usati per sfruttare l'energia della rottura dei legami dei fosfati
• Sito attivo, la tasca a livello della quale avviene la sintesi dell’RNA
• Canale di uscita per l’RNA sintetizzato, che esce da questo complesso dalla sua estremità 5’.

Un altro fattore importante nei procarioti è un fattore proteico, chiamato fattore sigma, che interagisce con il core enzima ed è essenziale per il riconoscimento del promotore, stimolando la trascrizione. Core enzima e fattore sigma insieme formano l’oloenzima, permettono l'inizio della sintesi, Questi permettono la combinazione tra RNA polimerasi e fattore sigma, ottenendo una struttura a mano aperta, che si posiziona sopra il promotore. A seguito della sintesi di una decina di nucleotidi ha inizio la sintesi abortiva, che si occupa del distacco del fattore sigma, in quanto non è più necessario, e permette la sintesi del filamento di RNA fino al segnale di terminazione.

I fattori sigma sono importanti per distinguere promotori diversi. Ad esempio, i procarioti hanno dei geni, la cui espressione può variare a seconda delle condizioni ambientali e ciò dipende dal fattore sigma presente nella cellula, la cui espressione cambia a seguito di segnali intrinseci o estrinseci. Le varianti dei fattori sigma sono quindi in grado di allocare il core enzima a livello di promotori diversi. In Escherichia Coli, ad esempio, troviamo almeno 7 fattori sigma, nel Bacillus Subtilis almeno 10. Alcuni esempi di fattori sigma in E. Coli sono:

• sigma70, che riconosce i promotori di geni housekeeping, che codificano per proteine sempre necessarie, sequenza -35 TTGACA e sequenza -10 TATAAT
• sigma54, che è coinvolto nella trascrizione dei geni regolati dalla concentrazione di azoto all’esterno della cellula e si attiva quando tale concentrazione varia
• sigma32, che è coinvolto nell’attivazione dei geni a seguito di shock termico. Non presenta TATA box.

Fase di allungamento

L’RNA polimerasi ha all'interno l'attività elicasica, fondamentale per l'apertura del doppio filamento, permettendo la formazione di una bolla di trascrizione, contenente 10-14 nucleotidi, e la capacità di ligasi. Dopo il passaggio della RNA polimerasi si ha la richiusura della bolla. La sintesi procede alla velocità di circa 50 nucleotidi al secondo. Oltre ad avere l'attività polimerasica ha anche l'attività esonucleasica, perciò, può sia aggiungere che rimuovere nucleotidi.

La rimozione di un nucleotide avviene a seguito dell’inserzione erronea dello stesso da parte dell’RNA polimerasi. Quando ciò avviene, il processo è costoso, in quanto non rimuove solo il nucleotide errato, ma anche decine di nucleotidi. L’RNA polimerasi fa un errore ogni 10000 nucleotidi aggiunti. Ci sono geni di varie dimensioni in cui gli errori possono non avere alcuna conseguenza, per questo non sempre vengono corretti.

Esistono due meccanismi di correzione:

• Editing pirofosfolitico, rimuove il nucleotide incorporato erroneamente tramite reincorporazione nel sito attivo dell’enzima di due gruppi fosfato (PPi)
• Editing idrolitico, torna indietro di uno o più nt, li elimina e ricomincia la sintesi.

Fase di terminazione