Processi fermentativi

COLTURA CONTINUA APERTA

Nelle colture continue vi è sempre un flusso in ingresso e uno in uscita dal fermentatore (SISTEMA

APERTO) e questa tipologia di fermentazione può essere protratta a tempi infiniti, perché si continua

a immettere e a togliere qualcosa dal fermentatore. Questa coltura ha dei tempi morti nettamente

batch, in quanto essi diventano trascurabili rispetto a quanto dura l’intero

inferiori rispetto alla coltura

processo. In una fermentazione continua, vi è un flusso in continuo di substrato e un flusso in uscita

che deve evidentemente uguagliare il flusso in entrata; questi flussi devono essere uguali e maggiori

di zero, in modo che il volume all’interno del fermentatore venga mantenuto costante.

Dal momento che si mantengono elevate velocità di crescita e produzione, in coltura continua la

produttività è più elevata rispetto alla coltura batch e questo consente anche di usare degli impianti

di dimensioni inferiori. Questo consente di avere dei volumi da trattare nettamente inferiori a quelli

che si avrebbero in batch, e questo di conseguenza determina una più semplice gestione del

processo di purificazione.

Se queste colture possono durare a tempi indefiniti, devo avere dei microrganismi robusti, stabili

geneticamente, in grado di crescere e produrre con elevate velocità, altrimenti non è conveniente

utilizzare una coltura continua. Inoltre, questa tipologia di fermentazione fa sì che i microrganismi

in quanto c’è

non risentano di fenomeni di tipo feedback e di fenomeni di repressione da catabolita,

sempre un flusso in entrata in cui si può decidere quale è la quantità di substrato che viene introdotta.

È possibile regolare la velocità specifica di crescita e la concentrazione cellulare nel fermentatore in

maniera indipendente; questo è importante perché posso cercare di modulare la concentrazione

della coltura o in modo tale che sia più

cellulare in modo da non avere problemi nell’aerazione

semplice smaltire il calore che si sviluppa durante il processo. Esistono tre tipologie differenti di

fermentazioni in continuo che si differenziano sulla base del parametro che viene controllato e reso

costante:

- CHEMOSTATO viene mantenuto costante il metabolismo del microrganismo. È il sistema

più utilizzato, perché se ho un controllo metabolico, sono in grado con il chemostato di

mantenere costante la velocità di sviluppo del microrganismo in un punto qualsiasi della

curva che mette in relazione mu con la concertazione del substrato

- TURBIDOSTATO viene mantenuta costante la densità ottica

- PH AUXOSTATO pH costante

Cinetica sviluppo biomassa

Quando si allestisce una coltura continua, la prima fase è sempre una FASE BATCH, cioè metto nel

fermentatore il terreno colturale, inoculo il microrganismo, lo faccio crescere fino a raggiungere lo

stadio di crescita di interesse a seconda del metabolita che si vuole ottenere; a questo punto inizia

l’ALIMENTAZIONE in continuo del fermentatore, cercando di regolare il flusso in entrata e il flusso

e in uscita, quindi c’è una FASE DI TRANSIZIONE tra sistema chiuso e sistema aperto, fino a

DI EQUILIBRIO tale per cui all’interno del fermentatore, la

raggiungere una CONDIZIONE

concentrazione di cellule, prodotto e substrato rimane pressochè costante (steady state). Se dx/dt

(velocità) è costante avremo che muX = FX/V. Le due X si semplificano e ottengo l’equazione

sottostante, in cui mu è uguale a D, ovvero alla velocità di diluizione. Andrò dunque a regolare la

portata in modo da avere il massimo sviluppo possibile coltura continua utilizzata per protrarre

all’infinito la crescita esponenziale. 33

Prendendo in considerazione il bilancio di massa, la quantità di cellule presenti nel fermentatore è

pari alla equazione seguente:

volta che viene fatto l’inoculo e fatta la prima fase di batch, si alimenta il fermentatore con il

Una

substrato e non con cellule, quindi anche le cellule in ingresso sono pari a 0. Quindi in una coltura

continua la quantità di cellule presenti dipende da quante cellule escono e da quante cellule nuove

si sviluppano.

Nelle fermentazioni continue il termine dX/dt indica la velocità con cui si accumulano o si diluiscono

le cellule all’interno del fermentatore. Quindi fondamentalmente la relazione ci dice che la quantità

di cellule presenti in un certo intervallo di tempo è pari alle cellule presenti in un certo momento

diminuita delle cellule che vengono fatte uscire dal fermentatore.

Nel momento in cui quindi ho a che fare con una coltura continua, devo fare in modo di immettere il

substrato con una portata e una concentrazione tale da permettere lo sviluppo cellulare e per far sì

che si sviluppino tante cellule quante sono quelle che fuoriescono con il flusso in uscita. Solamente

in questa condizione si raggiunge uno stato di equilibrio che viene definito STATO STAZIONARIO

o STEADY STATE, in cui tante cellule si sviluppano quante sono quelle che fuoriescono, quindi la

concentrazione cellulare rimane in questo modo costante. In questa situazione non si ha nè

accumulo né diluizione di cellule, quindi dX/dt = 0, quindi vale la relazione seguente, che ci dice che

la velocità specifica di crescita dipende dal flusso in entrata.

Regolando il flusso posso regolare la velocità specifica di crescita: se voglio una mu più alta, allora

aumento il flusso F, indipendentemente dalla concentrazione cellulare presente nel fermentatore.

La velocità specifica di crescita è dipendente solo dal flusso e non dalla concentrazione di substrato

S.

Nella prima fase in cui non viene raggiunto l’equilibrio dX/dt non è nullo, e non è nullo neanche nella

situazione produttività del processo, perché per incrementare la velocità specifica di crescita e quindi

questa situazione, l’equilibrio presente

la produttività posso agire sul flusso aumentandolo. In

all’interno del fermentatore viene alterato: nel momento in cui il flusso aumenta, aumenta la velocità

di diluizione D e quindi nel momento in cui aumento questa velocità, questa D diventa maggiore

della velocità specifica di crescita mu.

In una situazione di questo tipo, se D aumenta, se X diminuisce (perchè diluisco le cellule), la

concentrazione del substrato tende ad aumentare perchè la velocità di crescita del microrganismo

non compensa il consumo del substrato. La velocità specifica di crescita contemporaneamente

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continua ad aumentare (perchè aumenta la concentrazione di substrato) andando a raggiungere

nuovamente la velocità di diluizione, permettendo in questo modo di raggiungere una nuova

situazione di equilibrio dove dX / dt = 0.

Si potrebbe pensare di aumentare mu e D all’infinito, ma in una situazione in cui mu e D sono

massime si crea un SISTEMA INSTABILE, perché se si aumenta ulteriormente la velocità di

diluizione la velocità di crescita non può aumentare perchè è stata raggiunta una velocità specifica

Piccole fluttuazioni della portata in questa situazione, alterano l’equilibrio

di crescita massima. del

sistema, dando origine a un fenomeno che prende il nome di WASH UP: se supero la mumax e

quindi Dmax, la concentrazione cellulare all’interno del sistema tende a diminuire, perchè la velocità

a quella con cui si formano all’interno del

con cui vengono allontanate le cellule è maggiore rispetto

fermentatore.

Devo cercare dunque di regolare la portata quindi per raggiungere la mumax, ma mantenendomi al

di sotto di una soglia critica che determinerebbe la situazione di wash up.

Cinetica consumo del substrato

Il substrato è quello in ingresso, meno quello in uscita (=0 solo se viene completamente consumato),

il substrato necessario allo sviluppo cellulare, quello necessario per il prodotto di interesse, quello

necessario per il mantenimento del metabolismo.

La variazione di substrato nel tempo, sarà quindi pari al flusso in entrata del substrato, meno quello

in uscita, meno la quota necessaria per lo sviluppo cellulare.

Dal momento che F/V=D, posso fare questa sostituzione, quindi si ottiene che in condizioni di NON

EQUILIBRIO, la velocità istantanea con cui aumenta o diminuisce il substrato è legata all’equilibrio

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che si viene a creare tra la portata del substrato in ingresso e la velocità con cui il substrato viene

consumato per la crescita.

Risolvendo la relazione è quindi possibile andare a calcolare la concentrazione delle cellule in

funzione del substrato e da questa relazione vediamo che la quantità di cellule presenti nel

fermentatore è proporzionale alla quantità di substrato che viene consumato; la differenza rispetto

alla coltura batch, è che la concentrazione cellulare non dipende dalla velocità di sviluppo della

biomassa.

È presente una correlazione tra la velocità di diluizione D, la concentrazione di substrato S e quella

l’equazione di Monod,

di biomassa X. Se noi consideriamo mu viene correlata a S, ma sappiamo

che in condizioni di equilibrio mu=D, quindi l’equazione di monod può essere riscritta.

l’espressione per calcolare la concentrazione media di substrato

Risolvendo e sostituendo ciò che

abbiamo ricavato, riusciamo ad avere una relazione che correli effettivamente la velocità di diluizione

con la concentrazione di S e di X.

La concentrazione di cellule dipende dalla velocità di diluizione e dalla concentrazione di substrato,

inoltre se si aumenta il flusso e quindi la velocità di diluizione, si ha contemporaneamente un

aumento della velocità specifica di crescita, quindi la concentrazione media di substrato aumenta,

questo significa che viene convertito meno substrato in biomassa, quindi anche la biomassa

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diminuisce. questo significa che viene convertito meno substrato in biomassa, quindi anche la

biomassa diminuisce; viceversa, se si mantiene costante il flusso e D, e vado ad aumentare la

concentrazione di substrato in ingresso, si avrà un aumento della biomassa media all’interno del

fermentatore.

Quindi posso regolare la quantità di biomassa nel fermentatore variando la concentrazione del

substrato in entrata, o cambiando il flusso e la mu, o cambiando la concentrazione di substrato in

ingresso. Posso quindi agire su due parametri per cambiare indipendentemente mu o X.

In una coltura continua è quindi possibile controllare in maniera indipendente mu e X, agendo

rispettivamente sulla portata del substrato in ingresso mantenuto a concentrazione costante e sulla

concentrazione del substrato S mantenuto a portata costante.

Cinetica sintesi prodotto

L