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DETERMINAZIONE IN VITRO DELL'ATTIVITÀ ANTIMICROBICA
L'attività antimicrobica si stabilisce misurando la MIC (minima concentrazione inibente) del composto, definita come la più bassa concentrazione che inibisce una crescita visibile. Oppure la MCB (minima concentrazione battericida) corrisponde alla più bassa concentrazione di principio attivo in grado di inibire la crescita batterica di almeno il 99,9% rispetto alla popolazione iniziale.
Per determinare la MIC si utilizza il metodo per diluizione. Nei metodi di diluizione un inoculo standard del microrganismo da saggiare è esposto a diverse concentrazioni della droga di cui bisogna testarne l'attività antimicrobica. Le concentrazioni sono via via decrescenti. Si riempiono le provette e si lasciano un tempo di incubazione necessario affinché la droga possa svolgere la sua azione. Al termine dell'incubazione si può osservare il liquido all'interno delle provette.
che la crescita batterica sarà completamente inibita. Questa concentrazione corrisponde alla MBC (Minimum Bactericidal Concentration), che rappresenta la concentrazione minima di droga necessaria per uccidere completamente i microrganismi. Per ottenere questi risultati, è necessario utilizzare provette contenenti il liquido torbido con diverse concentrazioni di droga. Man mano che la concentrazione di droga aumenta, la torbidità diminuisce fino a ottenere un liquido limpido. La prima provetta in cui il liquido è limpido indica che la droga ha inibito la crescita visibile dei microrganismi e la concentrazione corrispondente a questa provetta rappresenta la MCI (Minimum Inhibitory Concentration), ovvero la concentrazione minima di droga necessaria per inibire la crescita batterica visibile. Tuttavia, la MCI non è necessariamente uguale alla MCB (Minimum Bactericidal Concentration), a meno che la droga abbia sia proprietà batteriostatiche che battericide. Per determinare la MBC, le provette in cui non si osserva crescita batterica vengono sottoposte a subcultura su terreno fresco privo di antibiotico. Di solito, la prima provetta limpida (partendo da destra) mostrerà una crescita batterica, mentre procedendo con le provette la crescita diminuirà fino a raggiungere la concentrazione corrispondente alla quale la crescita batterica sarà completamente inibita, e questa sarà la MBC.Il MCO non sarà in grado di crescere: questa concentrazione corrisponde alla MCB. Questo è l'esempio di una droga vegetale che ha un'attività batteriostatica e battericida a due concentrazioni diverse.
Un altro metodo utilizzato è quello della disco diffusione. La superficie della piastra di agar è inoculata con una quantità standardizzata del microrganismo da saggiare. Si possono testare più sostanze diverse tra loro, oppure una sola ma a concentrazione differente. Generalmente però viene utilizzata per testare più sostanze al fine di individuare quella con il potere antimicrobico maggiore.
I dischi di carta contengono un'appropriata quantità di agente antimicrobico e sono posti sulla superficie della piastra. La sostanza diffonde nel terreno e al termine dell'incubazione si forma un'area di inibizione di crescita attorno ai dischi, ovviamente in prossimità del disco ci sarà una
concentrazione di antimicrobico superiore che andrà a diminuire allontanandosi da esso. Esempio: "Studi preclinici sull'attività antifungina dell'olio essenziale di melaleuca alternifolia (tea tree oil) e del suo principale componente terpinen-4-olo" Scopo di questo studio è stato quello di valutare la possibile attività antifungina in vitro dell'olio essenziale di Melaleuca alternifolia Cheel (TTO) e dei suoi principali componenti terpinene-4-olo e 1,8-cineolo. I risultati sono espressi sulla tabella. Prima colonna: sono presenti i composti dell'olio essenziale. FCZ (fluconazolo) e ITR (itraconazolo) corrispondono a due farmaci di sintesi utilizzati comunemente per le infezioni micotiche. Seconda colonna: sono presenti i MCO, in particolare ceppi di Candida albicans. I primi 35 ceppi sono ceppi sensibili all'azione dei due antimicotici di sintesi, gli altri 14 ceppi sono invece resistenti. L'attività delteatree oil è stata valutata su tutti i ceppi. È stata valutata sia la MIC 50 che la MIC 90 che è la concentrazione fungicida. Il TTO ha un MIC 50 pari a 0,125, quindi è presente un'azione antifungina. L'azione sarà diversa o uguale nei suoi componenti (TERP e CIN) presi singolarmente? Il terpinene ha 0,03 ciò significa che è più attivo del TTO mentre il cineolo è pari a 2 quindi è meno attivo rispetto al terpinene e al TTO. Da ciò capiamo che l'attività antifungina del tea tree oil dipende soprattutto dal terpinene. Sia il TTO, che il TERP e il CIN hanno un'azione fungicida, cosa che non risulta per il farmaco di sintesi: osservando gli alti valori del FCZ possiamo intuire che non è un fungicida ma un fungostatico. Il TTO ha una risposta positiva anche nei confronti dei ceppi resistenti e nuovamente la sua azione è dovuta in gran parte al terpinene. Possiamo dire cheL'attività del TTO è superiore rispetto a quella dei farmaci di sintesi. Lo studio in questione fornisce un valido supporto sperimentale preclinico che potrebbe dar vita allo sviluppo clinico per capire se effettivamente sull'uomo si possono ottenere gli stessi risultati positivi.
Esempio: Effetto di una frazione ricca di polifenoli estratta dalla Sida urens contro i batteri responsabili delle carie dentarie e analisi delle sue proprietà anti-nocicettive.
Elenco dei batteri responsabili delle carie dentarie:
| Batteri | Diametro aloni (mm) |
|---|---|
| Frazione polifenolica | 10 |
| Gentamicina | 10 |
La componente ricca di polifenoli viene comparata alla gentamicina, antimicrobico di sintesi. Osservando la tabella si può notare che i dati della frazione polifenolica e della gentamicina sono molto simili tra loro, questo ci permette di dire che la componente polifenolica ha
un'attività antimicrobica simile a quella di un farmaco di sintesi. È possibile anche osservare che le due sostanze analizzate non hanno lo stesso effetto su tutti i MCO presi in considerazione. La frazione polifenolica non ha mostrato alcun effetto antimicrobico nei confronti di Pseudomonas aeruginosa, cosa che non si può dire per la gentamicina. Viceversa, sullo Streptococcus viridans e lo S. mutans la gentamicina non ha avuto alcun effetto, mentre la frazione polifenolica sì.
In questo caso è stata valutata la MIC: Ovviamente dove in precedenza non era presente la formazione dell'alone non c'è nemmeno la MIC.
In questo caso si valuta la MCB: Lo studio ha poi fatto il rapporto tra MCB e MCI dicendo che se il risultato veniva pari ad 1 o 2 considerava l'estratto battericida. Se invece il rapporto dava un risultato più alto allora attribuiva all'estratto un'attività batteriostatica. I risultati dimostrano
che su alcuni batteri si ha un'attività battericida mentre su altri solo batteriostatica. Lo studio ha anche valutato l'attività anti-nocicettiva (analgesica) della frazione polifenolica e l'ha paragonata ad un farmaco di sintesi, il paracetamolo (p.a. della tachipirina). Lo studio è stato effettuato attraverso il writhing-test con l'acido acetico che viene iniettato nel peritoneo dei topi dando origine ad un'azione irritante e si vanno a misurare il numero di stiramenti nell'unità di tempo. Al controllo non è stato somministrato nulla come potenziale farmaco ma è stata solo indotta l'azione irritante e si sono misurati il numero di stiramenti pari circa a 58. Questo funziona come controllo positivo. Con il paracetamolo il numero di stiramenti diventa 26, quindi si può dire che ha fatto effetto: ha ridotto quasi della metà il numero degli stiramenti. Si ha poi la componente polifenolica valutata.in modo dose-dipendente (100,200, 400) che ha un effetto antidolorifico maggiore del paracetamolo.L'Istituto Superiore di Sanità ha commissionato uno studio al fine di indagare l'effetto del basilico.
L'Ocimum basilicum (Labiatae) oltre ad essere una pianta aromatica utilizzata in cucina, in molti Paesi è una pianta medicinale di cui sono già riconosciute alcune proprietà terapeutiche (antinfiammatorie, antibatteriche e insetticide); essa, inoltre, contiene molti composti antiossidanti e possiede un forte potere antiossidante. Si è visto però che nella zona orientale del Marocco la pianta essiccata di Ocimum basilicum viene anche utilizzata in erboristeria come agente ipolipidemizzante e distribuita ad un elevato numero di soggetti iperlipidemici.
Tuttavia come spesso accade nella medicina tradizionale mancano sia gli studi scientifici a prova dell'attività ipolipidemizzante e
Potenzialmente aterogenica, sia quelli volti a valutare l'assenza di effetti nocivi. Lo scopo di questo studio è quello di valutare le proprietà ipolipidemiche dell'Ocimum basilicum in diversi modelli sperimentali.
Studio in vitro sul macrofago
L'ipercolesterolemia è il principale fattore di rischio delle malattie cardiovascolari. Il suo aumento si associa ad un incremento delle LDL, lipoproteine aterogene che possono indurre accumulo lipidico nelle cellule vasali. Le LDL ossidate accumulate all'interno del macrofago ne determinano una trasformazione in foam cell (cellula schiumosa) che rappresentano il primo step nella formazione della placca ateromatosa responsabile degli eventi cardiovascolari.
SCOPO: Valutazione del potenziale anti-aterogenico dell'Ocimum basilicum sul processo di accumulo di colesterolo in macrofagi umani.
Modello cellulare: macrofagi umani.
Droga vegetale: estratto etanolico di Ocimum basilicum, preparato a partire
da 50g di parti aeree di Ocimum basilicum essiccato, estratti con 250 mL di alcool etilico. PRIMO OBIETTIVO: effetti del trattamento per 24 ore con dosi crescenti (0, 20, 40, 60 e 100 μg/mL) di 1estratto etanolico di Ocimum basilicum sulla vitalità, morfologia e integrità cellulare, valutati rispettivamente con il test del Tripan Blu, osservazione microscopica e quantità di lattato-deidrogenasi citoplasmatica rilasciata nel mezzo di coltura cellulare. Saggio per valutare l’INTEGRITÀ CELLULARE: L'enzima LATTATO DEIDROGENASI (LDH) è un enzima normalmente presente nel citoplasma delle cellule che catalizzano la reazione di trasformazione del lattato in piruvato. In seguito ad un danno alla membrana cellulare l'enzima LDH dal citoplasma si riversa nel mezzo di coltura. RISULTATO: nessuna alterazione SECONDO OBIETTIVO: valutare la potenziale efficacia ipocolesterolemizzante del trattamento con estratto etanolico. Il macrofago viene incubato con LDL.modificate (acetilate), che posseggono un forte potere di induzione di accumul
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