Parassitologia clinica

METODI DI RILEVAMENTO DIRETTO DEL PARASSITA

- Esame a fresco (abbandonato; può servire in condizioni estreme)

- Striscio di sangue periferico (dà informazioni sulla specie)

-- Colorazione con May-Grunwald Giemsa

-- Limite di sensibilità = 100-300/ μl (10 minuti di osservazione)

- Metodo della goccia spessa (permette di rilevare i plasmodi anche in caso di basse parassitemie). Colorazione in Giemsa diluita 1:10-1:20 in H2O distillata per 30’, quindi delicato risciacquo in H2O tamponata): all’osservazione con il 100x saranno visibili solo parassiti extracellulari e leucociti. Limite di sensibilità = 10-20 parassiti / μl (10 minuti di osservazione)

Procedura del conteggio:

N° parassiti contati x 8000 = N° parassiti/ μl

N° leucociti contati

- Sierologia = Metodi indiretti – IFA (immunofluorescenza indiretta), IHA (emoagglutinazione indiretta – RBC vanno trattati e siero va decomplementato) ed ELISA. Non servono per diagnosi, ma

Per screening donatori, studi epidemiologici e monitoraggio di soggetti in terapia. Reazione di agglutinazione = formazione dell'agglutinato. Nei pozzetti a U, gli RBC tendono a depositarsi sul fondo del pozzetto = bottone di RBC sul fondo = REAZIONE NEGATIVA. Quando si ha agglutinazione si formano legami fra Ab e Ag che danno luogo a sedimentazione diffusa in tutto il pozzetto = mancanza bottone = REAZIONE POSITIVA. In IHA (emoagglutinazione indiretta) aggiungiamo emazie con antigene. Per iniziare si devono preparare le diluizioni scalari da 1:20 (es. 10ul di siero con 190ul di PBS, poi prendo 100ul di PBS in tutti gli altri pozzetti e aggiungo 100ul del pozzetto 1 nel 2, poi 100ul del pozzetto 2 nel 3 e cosi via).

DIAGNOSI DI SPECIE = striscio di sangue = emozoina Trofozoita giovane

SINTOMATOLOGIA e QUADRO CLINICO

Le manifestazioni cliniche della malaria sono molteplici e la loro evoluzione si basa sui fattori del parassita, i fattori dell'ospite, i fattori geografici e quelli socio-economici.

Statisticamente parlando, se 400 soggetti vengono punti da unazanzara infetta...

• 200 soggetti (quindi il 50% di 400) contraggono l'infezione;
• 100 soggetti (quindi il 50% di 200) sviluppano una malaria clinicamente manifesta;
• 2 soggetti (quindi il 2% di 100) sviluppano una malaria grave;
• 1 soggetto (quindi il 50% di 2) decede.

Sintomatologia clinica I sintomi iniziali della malaria sono molto aspecifici, infatti si ha febbre, cefalea, stanchezza, dolori muscolari e nausea/vomito. Solo in seguito si ha la comparsa della caratteristica febbre terzana/quartana ed è per questo che spesso la malaria viene diagnosticata tardivamente.

Febbre ad andamento altalenante che coincide con il ciclo schizogonico (da entrata in RBC a rottura RBC), che dura 48h per P. falciparum e altri e 72h per P. malariae legato al rilascio di EMOZOINA fa da ponte su membrana macrofagià àper plasmodio, che si lega al toll-like receptor TLR 9 ciclossigenasi.

attiva e produce prostaglandine che influenzano il centro ipotalamico della temperatura. È consigliato fare un prelievo nella fase apiretica per individuare i parassiti nei globuli rossi. La malaria grave può manifestarsi come una delle seguenti patologie: malaria cerebrale, anemia grave (particolarmente nei bambini) se l'emoglobina è inferiore a 5 g/dL. Le cause includono emolisi, aumento della clearance splenica dei globuli rossi non parassitati (a causa dell'attività fagocitante dei macrofagi splenici dovuta all'emozoina) e ridotta emopoiesi (aumento di TNF-alfa e inibizione della secrezione di EPO che porta a una ridotta produzione di globuli rossi). Altre complicanze della malaria grave includono ipoglicemia, edema polmonare/ARDS, insufficienza renale acuta e acidosi metabolica. La causa comune di queste patologie è il blocco dei globuli rossi parassitati nei capillari, mediato dal TNF-alfa che aumenta la loro capacità adesiva, riducendo così il flusso sanguigno e causando ipossia. Esiste un vaccino commercializzato nei paesi endemici che viene utilizzato nei bambini di età inferiore ai 5 anni per prevenire casi gravi di malaria. Per quanto riguarda la Babesia, si tratta di un genere di protozoi cherientrare nel Phylum Apicomplexa, sottoclasse Piroplasmia, ed è l'agente eziologico della babesiosi. Il suo ciclo vitale comprende la zecca Ixodes ricinus, che compie il pasto di sangue su grossi ungulati (come cervi e cinghiali) e l'uomo spesso si infetta quando, visitando le zone boschive (montuose o collinari) dove vivono questi animali, viene punto dalla zecca. Per Babesia esiste un rischio trasfusionale piuttosto alto perché lo screening sui donatori riguardo a questo parassita non viene fatto regolarmente e/o viene eseguito solo in alcune zone del nord/est Italia (dove il rischio di contrarlo è più alto). Per identificare le specie di Babesia l'osservazione al microscopio non è sufficiente (la diagnosi morfologica non può essere effettuata), quindi serve necessariamente un'analisi molecolare, solitamente una PCR. Qualora l'analisi molecolare non fosse attuabile, in base ai soli vetrini il clinico può

fareesclusivamente una diagnosi di babesionigenerica.

DIAGNOSI No emozoina + aspetto aàcroce di Malta.

Diagnosi specifica con tecniche molecolari.

TOXOPLASMA GONDIIProtozoo dixeno intracellulare obbligato.

1. Felino ingestione carne cruda (roditori uccelli) con infezione ed eliminazione di oocisti. Oocisti vanno aàcontaminare alimenti (es. verdure) e acque reflue. Uomo si infetta ingerendo alimenti contaminati.
2. Consumo carne di suini e ovicaprini infetti.
3. Trasfusione/emoderivati contaminati
4. Trasmissione verticale

Fasi ciclo = (1) intestinale nell’ospite definitivo,(2) esogena nell’ambiente esterno, (3)endogena nell’ospite intermedio- TACHIZOITA – elemento che si riproducemolto velocemente, tipico delle primesettimane di infezioni. Si riproducono perendoduogenia (asessuato). Distrutti dadigestione.

BRADIZOITI – crescono lentamente.Contenuti in cisti tissutali (++ muscoloscheletrico, miocardio, retina e SNC).Gastroresistenti – il

contenuto gastricodigerisce la cisti e fa sì che si liberino ibradizoiti nel lume gastrico e poi intestinale nel circolo ematico ritornano tachizoiti. - Immunità non sterilizzante. Immunità protettiva di tipo cellulo-mediato. IgG persistenti per tutta la vita, IgM permangono alcuni anni. Linfociti Th1 – TNF alfa e IFN gamma = attivazione macrofago con produzione di NO ha effetti diversi in base alla virulenza e al genotipo di T. gondii. Più comunemente si hanno genotipi a virulenza intermedia, il NO. Induce la formazione di cisti tissutali con bradizoiti, che rimangono tali fino a che la produzione di ossido nitrico (NO) è costante, oppure mediate con NK per l’uccisione del parassita. Se la produzione di NO cala, si ha la differenziazione in tachizoita – caratteristico degli immunocompromessi.

SISTEMI DI EVASIONE DI T. GONDII

• Variazione antigeni di superficie
• Inibizione fusione del fagolisosoma – se il parassita entra attivamente,

I lisosomi non riconoscono cosa distruggere nel macrofago; mentre se viene fagocitato, allora viene distrutto e attaccato dai lisosomi.

Modulazione risposta immunitaria dell'ospite

Manifestazioni cliniche della toxoplasmosi

La toxoplasmosi può manifestarsi in vari modi:

• Acquisita: se un soggetto immunocompetente contrae la toxoplasmosi può sviluppare manifestazioni cliniche blande (febbre, astenia e talora l'ingrossamento dei linfonodi cervico-occipitali). Solo nel caso di linfoadenopatia il soggetto s'insospettisce ed effettua delle analisi che vanno a svelare il Toxoplasma. In questi soggetti il decorso dell'infezione è benigno ed autolimitante terapia solo se Toxoplasma si localizza nella retina.
• Congenita: per trasmissione verticale. Le manifestazioni cliniche variano in base al trimestre di gravidanza in cui avviene l'infezione del feto:

Primo trimestre: "tetrade di Sabin" segni

neurologici gravi, idrocefalo, calcificazioni intracraniche è corioretinite toxoplasmici abortoà

Secondo trimestre: idrocefalo, microcefalo e corioretinite;

Terzo semestre: ittero neonatale con splenomegalia oppure forme inapparenti con possibili corioretiniti evolutive tardive;

- riattivazione: se un soggetto immunocompetente contrae la toxoplasmosi e poi va incontro ad una situazione di immunodepressione si ha la ridifferenziazione dei bradizoiti in tachizoiti con conseguente riattivazione toxoplasmicaà febbre, corioretinite, deficit neurologici, meningoencefalite oppure forme extracerebrali (miocardiche e/o polmonari) o disseminate. Nei pazienti con AIDS l’encefalite toxoplasmica poteva essere fatale nel 6-20% dei casi prima dell’introduzione della terapia HAART. La toxoplasmosi da riattivazione rappresenta in generale la più importante causa di lesioni intracerebrali.

DIAGNOSI

Diagnosi indiretta:

- Ricerca di anticorpi specifici

di classe IgM, IgG ed IgA- Valutazione dell'indice di avidità delle IgG- Western blot/immunoblot- Toxoferon- gold standard per la diagnosi di Toxoplasmosi. Incubazione dei toxoplasmi vivi con colorante conDYE test à siero del paziente di cui vogliamo valutare presenza Ab. IgG e IgM eventualmente presenti determinanol'uccisione del parassita parassita diventa bianco ultimo titolo in cui il 50% dei toxoplasmi è vivo è il titoloà del paziente.- Biopsie (quasi sempre si preleva un linfonodo ingrossato e lo si va ad incubare con anticorpi rivolti versoanticorpi anti-Toxoplasma eventualmente presenti nel siero del paziente).meno utilizzata e si svolge tramite tecniche per immagini oppure attraverso la ricerca del genomaDiagnosi direttaàparassitario all'interno di plasma, lavaggi bronchiali, liquidi amniotici ed umor acqueo sfruttando la PCR. Prima della PCRveniva eseguita la prova biologica, che consisteva nel prelevare il

marsi sulla patologia stessa. La toxoplasmosi è una malattia causata dal parassita Toxoplasma gondii. Questo parassita può infettare diverse specie di animali, compresi gli esseri umani. La trasmissione avviene principalmente attraverso l'ingestione di cibo o acqua contaminati con oocisti del parassita o attraverso il consumo di carne cruda o poco cotta contenente cisti del parassita. Nella maggior parte dei casi, l'infezione da Toxoplasma gondii è asintomatica o causa solo sintomi lievi e transitori simili a quelli dell'influenza. Tuttavia, l'infezione può essere grave o addirittura fatale per le persone con un sistema immunitario compromesso, come i pazienti con HIV/AIDS o le donne in gravidanza. La diagnosi della toxoplasmosi può essere effettuata attraverso diverse tecniche. Oltre alla tecnica descritta in precedenza, che coinvolge l'inoculazione di plasma o liquido peritoneale di pazienti in cavie da laboratorio, ci sono altre metodologie più moderne e sensibili. Una delle tecniche più comuni è l'analisi del sangue per la ricerca di anticorpi specifici contro Toxoplasma gondii. Questa tecnica può rilevare la presenza di anticorpi IgM e IgG nel sangue del paziente. Gli anticorpi IgM indicano un'infezione recente, mentre gli anticorpi IgG indicano un'infezione passata o una protezione immunitaria. Altre tecniche diagnostiche includono la PCR (Reazione a Catena della Polimerasi), che permette di amplificare e rilevare il DNA del parassita nel sangue o in altri campioni biologici, e l'immunofluorescenza, che utilizza anticorpi fluorescenti per rilevare la presenza del parassita. La diagnosi precoce e accurata della toxoplasmosi è importante per garantire un trattamento tempestivo e adeguato, soprattutto nelle persone con un sistema immunitario compromesso o nelle donne in gravidanza. Inoltre, la diagnosi corretta può aiutare a prevenire la trasmissione dell'infezione ad altre persone attraverso trasfusioni di sangue o trapianti di organi. In conclusione, la toxoplasmosi è una malattia causata dal parassita Toxoplasma gondii e può essere diagnosticata attraverso diverse tecniche, tra cui l'analisi degli anticorpi nel sangue, la PCR e l'immunofluorescenza. La diagnosi precoce e accurata è fondamentale per garantire un trattamento adeguato e prevenire la trasmissione dell'infezione.