Moduli di Microbiologia

Introduzione

Anche nell'ambito dei procarioti ci sono state delle tappe importanti nella scoperta genomica. Viene indicato il 1995 come tappa dell'era genomica, data che coincide con la pubblicazione del primo genoma procariotico di Haemophilus influenzae. I primi ad essere stati sequenziati sono i Fagi, dato che sono quelli più piccoli, poi a seguire incominciano i genomi procariotici, primo tra tutti quello dell'Haemophilus influenzae, poi è stato sequenziato il primo genoma eucariotico di Saccharomyces cerevisiae e, infine, il genoma di Drosophila Melanogaster per finire con il genoma di Homo Sapiens.

Possiamo avere diversi aspetti inerenti alla genomica: il primo di questi è la genomica strutturale. Quando si inizia a studiare un genoma di un microrganismo, infatti, la prima cosa da fare è andare a vedere la struttura partendo dalla sequenza delle basi (nel genoma non è importante studiare solo i geni, dal momento in cui le porzioni

Nongeniche sono fondamentali nella regolazione e nella filogenesi). Per cui, per genomica strutturale, si intende lo studio della struttura del genoma, l'identificazione di geni e dei loro rispettivi prodotti di espressione, di elementi regolatori ed altre entità informazionali. Il passo successivo alla genomica strutturale è quella funzionale, la quale studia le funzioni dei geni, delle loro interazioni e dei meccanismi che regolano l'espressione. Negli ultimi anni si è fatta avanti anche l'idea di genomica comparata. Quando si analizza un genoma bisogna tenere conto di dimensioni, proteine e porzioni non codificanti. Il genoma di un batterio è circolare nella maggior parte dei casi, a eccezione di Borrellia e Streptomyces che presentano un genoma lineare. Per quanto riguarda i cromosomi, questi generalmente vi è un singolo cromosoma, anche se, in alcuni casi, vi possono essere presenti due cromosomi con informazioni rispettivamente diverse.

seppur correlate. In alcuni casi possono essere presenti megaplasmidi (Agrobacterium, Brucella, Rhizobium, Rhodobacter, Burkholderia*, alcuni Bacillus thuringiensia e Leptospira) che codificano per funzioni essenziali. I genomi eubatteri mostrano una notevole variabilità nelle dimensioni, normalmente correlate al loro stile di vita. Ad esempio, le Clamidiae, o i Micoplasmi, che non hanno parete cellulare, avranno un genoma di dimensioni ridotte (poiché non sono presenti geni per la parete cellulare). Un altro esempio lo possiamo fare con i simbionti intracellulari obbligati e patogeni (specializzati) e i batteri a vita libera (generalisti): i primi hanno genomi piccoli molto stabili con riarrangiamenti genomici scarsi o nulli; gli ultimi hanno dei genomi più grandi con riarrangiamenti genomici frequenti ed alto grado di variabilità nel contenuto genico sia a livello inter-specie che intra-specie. Inoltre, i genomi archebatterici hanno dimensioni pocovariabili.Generalmente si sequenziano più microorganismi appartenenti alla stessa specie, in quanto la Genomica Comparativa ha messo in luce il fatto che ci possono benissimo essere delle differenze sostanziali tra i vari microorganismi (anche se di una stessa specie), mentre comunque tutto ciò che serve per la sopravvivenza sarà comune a tutti i ceppi di una specie. Nel genoma procariotico possiamo distinguere il nocciolo genico (core, porzione stabile) e i geni accessori (porzione flessibile). Nel core sono presenti tutti i geni fondamentali, ovvero i geni ribosomiali, quelli del metabolismo e quelli della replicazione. Nell'altra porzione sono presenti geni che possono cambiare e subire delle modificazioni senza andare ad intaccare eventualmente la sopravvivenza (plasmidi, integroni, fagi, trasposomi o comunque anche tratti di DNA che determinano resistenze ad antibiotici, patogenicità). I plasmidi si trovano nella parte che riguarda i geni accessori anche se

presentano, loro stessi, geni conservati e geni flessibili, in quanto anche essi hanno delle regioni stabili che gli consentono ad esempio di mantenersi e di replicarsi, e quindi vanno a costituire quello che è il core della struttura plasmidica (ma di per sé il plasmide è un accessorio della cellula batterica).

Tutti questi elementi sono quelli che determinano la plasticità genomica, ovvero il continuo rimaneggiamento del genoma.

Nel 1958 Francis Jacob ed Elie L. Wollman proposero che la struttura del cromosoma di E. coli fosse circolare. In effetti il DNA di E. coli è lungo ed è avvolto fortemente su sé stesso, avvolgimento determinato da enzimi:

Nell'ambito delle cellule eucariotiche il DNA viene fortemente compattato ad opera di proteine istoniche che vanno a costituire e superavvolgere il cosiddetto nucleosoma. In E. coli, invece, il DNA risulta fortemente avvolto con delle proteine come a creare diversi domini. Questo avviene perché,

essendo una sola molecola, per consentire che avvenga la duplicazione del DNA non è necessario lo scioglimento dell'intera molecola ma solo del dominio di quella porzione di interesse (questo è un metodo di risparmio energetico). Il nucleoide dei procarioti è funzionalmente analogo al nucleo della cellula eucariotica. Sia nei procarioti che negli eucarioti, sono presenti delle proteine SMC che svolgono una funzione diversa: - Negli eucarioti sono responsabili del mantenimento della struttura del cromosoma, della formazione di domini del DNA, della segregazione dei cromosomi e della riparazione del DNA mediante ricombinazione; - Nei procarioti partecipano alla condensazione del cromosoma insieme a dei piccoli polipeptidi presenti ad alte concentrazioni nella cellula, chiamati NAP (Nucleoid-Associated-Proteins) con funzione analoga a quella degli istoni negli eucarioti. Data l'importanza di queste cellule, si è visto che un gene mukB, omologo a queste SMC,subunità di GyrB (responsabili dell'avvolgimento del DNA). Le girasi sono coinvolte nel processo di superavvolgimento del DNA, che è essenziale per la sua corretta funzione. Il gene gyrA codifica per la subunità A della girasi, mentre il gene gyrB codifica per la subunità B. Entrambe le subunità sono necessarie per l'attività della girasi e per il corretto superavvolgimento del DNA. La girasi agisce creando rotture nel DNA a doppia elica, permettendo al DNA di rilassarsi e superavvolgersi correttamente. Successivamente, la girasi ripara le rotture e ripristina il DNA nella sua forma superavvolta. La presenza di girasi è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule, in quanto il superavvolgimento del DNA è essenziale per molti processi cellulari, come la replicazione del DNA, la trascrizione genica e la ricombinazione del DNA. In conclusione, la girasi è una proteina chiave nel mantenimento dell'integrità del DNA e nel suo corretto funzionamento. Senza di essa, il DNA sarebbe più suscettibile a danni e alterazioni, compromettendo la sopravvivenza delle cellule._subunità di GyrB (che idrolizzano l’ATP, dando energia per svolgere questo avvolgimento). Le topoisomerasi I invece tagliano una singola elica determinando lo scioglimento del DNA. Il Methanothermus fervidus (ipertermofilo archea), poiché vive in ambienti estremi, ha una girasi inversa che introduce dei superavvolgimenti nell’andamento opposto al normale, in modo da proteggere il DNA. Il DNA può essere danneggiato dalla temperatura ed è per questo che, in quei batteri che vivono a temperature estreme, vi è tutta una serie di proteine che proteggono il DNA anche da denaturazione: denaturare significa sottomettere il DNA ad uno stress termico talmente forte da determinare l’apertura delle due eliche di DNA. Questa caratteristica è quella che viene sfruttata normalmente negli esperimenti in laboratorio: viene usata una temperatura di fusione (Temperatura di Melting, TM:definita come la temperatura media a cui viene denaturato un

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determinato filamentodi DNA) e una temperatura di rinaturazione (riassociazione delle due eliche di DNA).

Nel metodo della PCR, una tappa fondamentale per fare l'amplificazione è l'utilizzo di inneschi che poi si accoppiano:

Il DNA può assumere delle strutture secondarie che, specialmente nell'ambito procariotico, sono fondamentali e frequentissime:

Ad esempio, la presenza delle sequenze invertute e ripetute possono determinare la formazione di strutture a stem and loop (a forcina). Oppure possono avere delle estremità coesive, che non sono altro che sequenze invertite e ripetute con la caratteristica di essere fra loro compatibili e, quindi, si arrotonda (queste si possono creare anche in laboratorio con enzimi di restrizione).

Ma quali tipi di proteine si possono avere?

Le proteine che abbiamo appena visto sono delle proteine che si legano al DNA in modo non specifico, ovvero non hanno un target specifico su cui legarsi in quanto non hanno a che fare con i

Sistemi di regolazione e di espressione. Nella genetica umana, tra quelli che sono specifici troviamo le strutture omodimeriche, le quali hanno dominiche riconoscono dei target e che hanno a che fare con sequenze inverted-repeated, molto frequenti nel genoma. Tra queste proteine abbiamo: L'interazione proteine-DNA è un processo fondamentale nella replicazione, trascrizione e traduzione. Vi sono interazioni specifiche e non specifiche.

REPLICAZIONE DNA NEI GENOMI BATTERICI

In tutti i genomi batterici la replicazione avviene in un punto di crescita detto forcella, il quale scorre linearmente lungo tutto il filamento a partire da un punto di origine di replicazione specifica fino a un punto di terminazione. Il cromosoma di E.coli è circolare per tutta la durata della replicazione. Il DNA batterico rimane ancorato alla membrana cellulare a livello del mesosoma affinché la divisione avvenga nella maniera più corretta e sicura possibile (è stato possibile).

notare questo attraverso degli esperimenti di marcatura: questo ancoraggio o probabilmente avviene nel punto di crescita, dato che, lisando le cellule dopo una breve esposizione ad un precursore radioattivo, si è visto che il DNA neosintetizzato risultava legato alla membrana). Quest'ancoraggio al mesosoma lo si può trovare anche nel caso dei plasmidi: una cellula batterica può perdere un plasmide e continuare a vivere comunque senza problemi; però ci sono dei plasmidi, che sono di grosse dimensioni e per evitare la perdita si associano al mesosoma durante la segregazione del cromosoma, in modo tale che se va il cromosoma va via anche il plasmide con lui. Nel caso dell'E. coli si è visto che le forcelle di replicazione partono in corrispondenza di un punto di origine della replicazione detto ORI-C, mentre nel punto in cui finisce c'è una proteina TUS che si lega al sito specifico, che è la sequenza TER, determinando il blocco.

della rep