Miglioramento genetico del riso per la resistenza alla salinità

MIGLIORAMENTO GENETICO DEL RISO PER

LA RESISTENZA ALLA SALINITA’

Il riso (Oryza sativa) è uno dei tre cereali più consumato al mondo,

insieme a mais e frumento. Sviluppato migliaia di anni fa nel centro di

origine indiano, si è diffuso in tutto il mondo, arrivando ad occupare

150 milioni di ettari di superficie di coltivazione, grazie ad anni di

miglioramento e ad una continua evoluzione delle tecniche di

coltivazione. . Il riso necessita di passare periodi relativamente brevi in

sommersione (10-15) cm, tecnica che permette, oltre alla normale

irrigazione, di proteggere il riso da sbalzi termici elevati.

L’acqua deve, innanzitutto,

raggiungere tutte le zona della

camera di risaia con la stessa

profondità. Poi deve entrarci

piano piano, per non erodere il

fondo e non staccare le

piantine. Allo stesso modo deve

uscire rapidamente quando la

risaia deve essere messa in

asciutta. Mentre la camera di

risaia è allagata l’acqua deve

sempre scorrere lentamente, per

fornire ossigeno necessario alla

germinazione del seme e

contrastare la formazione di

sostanze in putrefazione.

Al giorno d’oggi, i cambiamenti climatici sono una realtà con cui l'agricoltura deve fare i

conti, e in futuro è previsto che nell'area del Mediterraneo le precipitazioni si faranno più

scarse e che l'acqua disponibile per l'agricoltura sarà di minore qualità.

Ad esempio nelle zone litoranee il cuneo

salino si farà sentire di più, e già oggi chi

coltiva riso nella zona della foce dell'Ebro, in

Spagna, o in Camargue, in Francia, deve fare i

conti con una crescente salinità dell'acqua

inevitabile il miglioramento genetico

del riso al fine di incrementarne la

resistenza alla salinità

Una delle tecniche più utilizzate è la transgenesi,

tecnica di ingegneria genetica che permette l'inserimento

di un gene esogeno all'interno del genoma di

un organismo bersaglio che funge da ospite (chiamato

transgene). Una volta identificato il gene di interesse , si

realizza una sequenza di nucleotidi che comprende la

sequenza codificante la proteina di interesse a valle di un

gene promotore (per consentire la trascrizione) e a monte

di un terminatore di trascrizione. In alcuni casi

l'inserimento del transgene avviene attraverso l'uso di un

vettore che può comprendere sequenze che regolano l’

espressione del gene.

Le specie di orzo selvatico riescono a sopravvivere in ambienti difficili, essendo

dotati di elevata resistenza a stress abiotici come la siccità e lo stress da sale, e

potrebbero fornire un pool genetico d'elite per il miglioramento delle colture.

Il processo di miglioramento è stato svolto in 3 fasi:

• mappaggio dei QTL che rispondono allo stress da sale nel riso e

nell'orzo selvatico

• identificazione di geni che codificano per proteine CLB

• trasferimento dei geni di interesse dall'orzo selvatico al riso

Si è vista l’ importanza di alcune proteine CLB, la cui sovraespressione

favorisce un aumento della resistenza agli stress salini. Tale sovraespressione

di queste proteine ha portato ad un maggiore accumulo di osmoliti, come la

prolina.

CLB: chiamate calcium-dependent lipid-binding protein, sono piccole

proteine con domini di legame specifici per il Ca2+, che si attivano in

risposta a diversi fattori abiotici, tra cui sale, freddo, siccità, mettendo in

atto un’ampia varietà di meccanismi.

Una di queste proteine CLB è

stata usata per aumentare la

resistenza al sale nel riso. Si tratta

della proteina HsCBL8, il cui

gene codificante è stato clonato

da una specie di orzo selvatico

(H. spontaneum) originario del

Tibet e altamente tollerante a

gravi stress da sale. PROCEDIMENTO

• La sequenza codificante HsCBL8 dell’ orzo selvatico è stata clonata

utilizzando la PCR inversa (usando come stampo un frammento di

RNA)

• Modifica di un vettore binario di agrobacterium attraverso inserimento

di un promotore e di un terminatore

• Il DNA genomico della regione di codifica HsCBL8 è stato inserito

nel plasmide, per formare il vettore di espressione

• Inserimento del transgene nella pianta attraverso trasferimento ditetto

CONCLUSIONI

Per valutare il possibile ruolo di HsCBL8 nella tolleranza al sale, sono

state confrontate la crescita delle piantine e la morfologia delle linee di

riso transgenico (L1 e L2) con quella delle piante di controllo (ZH11),

in condizioni di stress normale e 125 mM NaCl.

• differenze insignificanti nella germinazione dei semi (inteso come

semi germinati) e nel peso fresco delle piantine tra le piante

transgeniche e ZH11 in condizioni di crescita normali

• osservate variazioni significative nel tasso di germinazione dei semi e

nel peso fresco della piantina tra le linee transgeniche e le ZH11 non

transgeniche sotto lo stress di 125 mM NaCl.

PROBLEMI

• Transgenesi vietata in molti paesi

• Consumatori diffidenti verso questa tecnica di miglioramento

• Lento progredire di questa tecnica (a causa delle motivazioni

sopracitate)

NECESSITA’ DI NUOVE TECNICHE DI MIGLIORAMENTO

Un ulteriore esperimento per ottenere la tolleranza alla salinità in riso è stato

condotto a partire dall’incrocio tra una varietà di riso japonica coltivato Ningjing

16 (NJ16) e una specie selvatica Dongxiang (riso selvatico comune cinese

conosciuto anche come Oryza rufipogon Griff). Questo metodo permette il

trasferimento del gene di interesse in una pianta senza l’ uso della transgenesi,

utilizzando solamente l’incrocio, ragion per cui la pianta modificata non verrà

considerata OGM. Tale incrocio è stato poi sottoposto a 4 backcross (NJ16

genitore ricorrente) con l’ottenimento di una linea DJ15 (Dongxiang/Ningjing

15) tollerante alla salinità.

La tolleranza al sale è stata valutata rispetto a NJ16 di partenza e ad una cultivar di riferimento (96D10). È

stato calcolato il tasso di germinazione di 200 semi di riso per ogni campione, dopo che questi sono stati

esposti alla temperatura di 45 °C per 3 giorni e immersi in una soluzione salina a 25°C per una notte (il

trattamento termico si è reso necessario per favorire l’uniformità nella germinazione dei semi).

Successivamente, è stato calcolato il tasso di sopravvivenza delle piantine di riso di un mese in seguito al

trasferimento in campo salino. Il trattamento con NaCl ha permesso di dimostrare che DJ15 è più tollerante

in fase di germinazione, subisce un minor danno alle foglie che appassiscono ed è dotata di una resa

superiore rispetto alle parentali.

L’ obbiettivo dell’esperimento non fu soltanto la costituzione di una linea dotata di tolleranza alla salinità,

ma la comprensione delle cause che avevano portato all’ottenimento di questa. L’analisi è stata condotta

contemporaneamente su due fronti:

Identificazione dei geni di riso selvatico Mappatura dei geni responsabili della

introgressi in DJ15 tolleranza