Microtubuli

Contatto laterale sulla linea di giunzione: ab, eterologo. Contatto nella

parete: aa/bb, omologo.

Non esistono solo i mt 13:3. In generale variano da 8 a 19 filamenti e

da 2 a 4 eliche di start. Ci sono dei metodi per predire l’esistenza

di un microtub costituito da un tot di protofilam e un tot di eliche

di start, non tutti quelli che potrebbero esistere poi effettivamente sono

stati osservati. Quella che prendiamo di riferimento è la 13:3 perché è

quella tipica e ha anche una peculiarità aggiuntiva, ovvero ho le eliche

che continuano perfettamente con i protofilamenti cioè hanno la

giunzione dritta perfettamente verticale parallela all asse del mt.

Il 13:3. È come se avessi degli strand a-b-a che si avvolgono, ho la

striscia nera che occupa lo spazio di un monomero, quella chiara di due

monomeri. Ho continuità negli strand che si alternano ad ogni

avvolgimento: strand a-strand b-strand a…, sono tutti interfacciati

perfettamente con contatti eterologhi alla giunzione con

sfasamento di 0.92 nm. A e A’ coincidono alla giunzione, ho match

perfetto. Quindi la giunzione 1-13 risulta dritta.

Se uso invece 14 protofilam, vedo un mismatch tra A e A’. Il problema

si potrebbe risolvere in due modi: uso uno sfasamento diverso da 0,92

nm, minore perché dev essere moltiplicato per 14 > 13 es di 0,8 e

qualcosa nm, ma così cambierei i contatti lat tra monomeri che

necessiterebbero un energia superiore rispetto a quelli previsti, quindi

non è la soluzione che la natura adotta; la soluzione consiste nell

inclinare la giunzione tangenzialmente rispetto al cilindro, di un

angolo teta per riallineare A e A’ lungo la giunzione, dove teta

dipende dal numero dei protofilamenti, genero una torsione, così

riottengo la continuità, torsione quindi struttura quinaria.

Consideriamo il MT 13:3.

Ho continuità tra la striscia di a e la successiva di b. Abbiamo

continuità tra le eliche, quindi i protofilam sono paralleli tra loro e

all asse del mt.

R = 0.92 nm è lo sfasamento relativo tra i protofilamenti ed è

 indipendente dal numero di protofilam

N0 è il num di protofilam del caso base cioè 13 protofilam.

 P0 è lo sfasamento totale che si registra nel caso base alla

 giunzione tra il primo e il tredicesimo protofilamento quindi qui 12

nm

S0 è lo sfasamento tot ma in num di monomeri quindi qui di 3

 monomeri

a è l’altezza di un monomero ed è di 4 nm



Ora lo disegno con i protofil sul piano. Nel 13:3 la prima elica in basso va

a congiungersi perfettamente con la quarta elica, con contatto eterologo.

Ora ridisegno con un N diverso da 13. Allora non ho continuità tra gli

strand consecutivi, non ho un corretto match. Lo sfasamento associato al

mismatch è deltaN e corrisponde alla differenza tra l altezza dall

orizzontale raggiunta dalla prima elica quando termina il giro

(D_N) e l altezza a cui parte la quarta elica (D).

Il segno non ci importa in realtà per il deltaN.

Come si risolve il problema del mismatch?

1. Posso cambiare R in modo da far coincidere A con A’.

2. Vario l inclinazione dei protofilam rispetto all asse del MT.

Inclinazione rispetto alla verticale della giunzione. Genero una

torsione.

1)

Ipotizzo che per 14, che è vicino a 13, le eliche di start a cui riportare S

siano comunque 3, abbassando leggermente R.

Il deltaR è molto piccolo, quindi le interaz lat cambiano ma gli aa

coinvolti e i leg rimangono gli stessi anche se leggermente

spostati, quindi la struttura si sposta dal minimo energetico

quindi servirebbe dell energia da fornire per raggiungere questo

valore di deltaR. Quindi la natura non lo adotta come espediente.

Il numero di eliche di start a cui correggermi è quello + vicino

cioè quello che comporta il deltaR minimo cioè la variazione

energetica minima. Per esempio con 16, l S migliore è 4 perché

comporta un deltaR piccolo. Per N>N0 cercherò un S pari a S0 o

superiore, al contrario per N<N0 cerco un S<=S0.

2)

Caso base:

Caso con mismatch:

Devo inclinare di tetha in senso antiorario.

Tra B e B’ ho il mismatch di deltaN.

Il delta N è pari a P0*(N/N0 -1) = R0*(N-N0).

Devo ruotare di un theta tc B finisca per coincidere con B’ ovvero

tc che B si abbassi di deltaN. Questo deltaN dev essere pari al

cateto opposto del triangolo che ha ang teta e cat adiacente N

volte la larghezza dei monomeri ovvero deltax.

Il monomero libero ha larghezza di 6 nm 8dal modello atomico),

quando li assemblo nel MT a causa di parziali compenetrazioni

ottengo un deltax sperimentale + basso = 5,15 nm. Oppure posso

fare una stima geometrica considerando il numero di protofilam e la

lunghezza della circonferenza del MT e così otteniamo una stima vicina

al dato sperimentale.

È un angolo molto piccolo, <1°. Questa inclinazione crea un elica, che

si vede percorrendo la giunzione inclinata a causa della torsione,

che ha un ordine di micron cioè un passo molto grande quindi è

visibile solo su MT molto lunghi.

Generalmente per il passo del superavvolgimento (o pitch) si

considera in modulo. Il segno lo si assegna a seconda che l

avvolgimento sia destrorso o sinistrorso, questa è la convenzione.

A un angolo teta maggiore corrisponde un passo minore cioè una

torsione +marcata. Tetha aumenta all aumentare di N fissato un certo

numero di eliche di start.

In natura vengono osservati anche microtubuli con sfasamenti diversi da

0.92 nm. Quelli con R=0.92 nm sono le strutture di tipo A. Le

strutture di tipo B hanno uno sfasamento maggiore, in cui se su un

protofilam ho due dimeri successivi, in quello adiacente ne ho uno che si

mette in mezzo a quei due quindi non ho un contatto omologo a-a o b-b

bensì 1 monomero vs ½ monomero sopra e 1/2 monomero sotto, ovvero

staggered, in cui ho a-b, ho contatto eterologo, ho uno sfasamento

totale ovvero di 4 nm che equivale a un intero monomero. lo sfasamento

definisce la struttura del MT (A o B).

Ci sono poi i tipi di MT, che dipendono dal fatto che il MT sia chiuso o

aperto. MT di tipo A si chiude ed è completo, MT di tipo B non si

chiude ed è quindi incompleto. A deve avere 13 protofil per chiudersi,

sotto i 13 non si chiudono.

I microtub di tipo B hanno sempre struttura B, quelli di tipo A possono

avere strutt A o B.

Trovo questi MT nell’assonema, come in ciglia flagelli e assoni. Ho

due MT centrali di tipo A da 13 protofil, e 9 doppietti in cui un MT

ha 13 protofil ed è di tipo A (con strutt di tipo A o B) e l'altro ha 11

protofil ed è di tipo B.

Polimerizzazione/depolimerizzazione mt

lI microtubulo si forma per il processo di polimerizzazione, ovvero l

aggiunta di dimeri alla +end del MT. A questo punto il gtp della b si

idrolizza a gdp, la tasca si chiude per aggiunta del dimero e passa da

sito E a sito N, si parla quindi di idrolisi accoppiata (alla

polimerizzazione), ovvero l aggiunta di un dimero a quello sottostante

cambia la velocità di idrolisi del gtp rispetto alle condiz normali e la

velocizza. Gli ultimi dimeri che si sono aggiunti hanno ancora il

gtp, quindi questi dimeri hanno contatti lat ancora forti, questi dimeri

+stabili con gtp costituiscono il GTP cap.

Come si forma un microtubulo in vitro:

In soluzione abbiamo delle tub a e b, GTP, ioni Mg++, manteniamo T

a 37° (sotto certe T la polimerizz non avviene più).

Analizzo la polimerizz nel tempo, andando a vedere la [] di dimeri di

tub che si aggiungono al mt nel t. L’ andamento della curva è a

sigmoide, quindi all’inizio è lenta poi è +veloce poi rallenta di nuovo in

modo asintotico.

All’inizio ho un tempo di latenza ovvero la fase di nucleazione,

quando si formano i seed di nucleazione ovvero degli oligomeri stabili

quindi non +solubili che possono fungere da punto di partenza per il mt.

Poi comincia una crescita veloce che è la fase di allungamento.

Quando il mt consuma tutti i dimeri, la sua lunghezza si stabilizza e

entra nella fase di steady state.

Differenze tra polimerizzazione in vitro e in vivo dei mt:

In vitro, se non succede nient’altro, dopo lo steady state il mt

depolimerizza, è destinato a disassemblarsi. Invece in vivo nelle cell

viene stabilizzato, grazie a delle proteine stabilizzatrici che

blocchino gli scambi alla +end, cioè le proteine di capping, che

mantengano la lunghezza del MT raggiunta quindi il MT diventa

stabile.

La pendenza del tratto di crescita dipende dalla fase in cui si trova

la cell, se la cell è stabile in quiete allora la v di crescita è bassa, se la

cell è in movimento o in divisione allora la v è alta, quindi la v non è

fissa in vivo, mentre in vitro si.

In vivo i microtubuli partono dal centro organizzatore dei MT o

centrosoma, quindi alla -end non crescono perché è bloccata lì,

crescono solo alla +end, quindi partendo da una struttura preformata

nel centrosoma non c è la fase di nucleazione perché i seed sono

preesistenti. In vitro invece crescono sia alla +end che alla -end,

con velocità > alla +end.

Quindi la curva in vitro è una sigmoide, con fase di

nucleazione/seeding + allungamento + steady state, che si ripete

ciclicamente a causa del collasso del mt dovuto alla sua instabilità

intrinseca, la pendenza della crescita è fissa.

La curva in vivo invece presenta solo la fase di allungamento +

plateau, il collasso è impedito dalla presenza delle proteine

stabilizzatrici, e la pendenza della crescita dipende dallo stato

della cell.

I MT nella cell partono tutti dal centrosoma e poi si sviluppano a raggiera

e stanno lì, sono stabili e permanenti. Ma si possono osservare anche MT

che si comportano come in vitro, perché se nella cell in un punto si

accumulano dei dimeri, si formano dei MT liberi ma poi si disgregano

dopo tipo 10 min perché non vengon stabilizzati quindi sono labili.

Nello schema c’è la fase di allungamento e di accorciamento. Fase di

allungamento: Stiamo seguendo uno dei protofilamenti del MT. All’inizio

il MT è formato da 4 dimeri, 3 dimeri hanno già idrolizzato (hanno il gdp –

D) e l’ultimo non ha ancora idrolizzato (ha il gtp – T). Il dimero azzurro è

marcato e è quello che sto seguendo. Quando aggiungo un dimero T

alla fila, quello precedente da T passa a D ovvero idrolizza, fatto

che è un’evidenza sperimentale, ovvero la polimerizzazione con

idrolisi accoppiata. E continuano ad aggiungersi dimeri analogamente.

Quando non ho + dimeri in soluzione, anche solo localmente, il MT è

lungo, la crescita rallenta, il MT rimane a qu