Microbiologia generale

TASSONOMIA

Scopo: classificare organismi e dare nomi

Specie biologica=insieme di individui in grado di incrociarsi naturalmente e produrre progenie

fertile

Microbiologia 23/24 Naomi Rinaldi

In microbiologia no riproduzione sessuata

Specie batterica=microrganismi con caratteristiche comuni che si differenziano

considerevolmente da altri gruppi

Approccio biochimico:

• Morfologia

• Nutrizione e fisiologia

• Motilità

• Altro

Step per classificare:

• Campione: suolo o clinico

• Semina: su 2 Petri sterili in una semino campione, sull’altra campione diluito in acqua

• Incubazione: con termostato a T precise (urine 37°C, terreno 30°C)

• Osservo risultati: coltura pura o mista?

Coltura pura=colonie di 1 solo organismo->stessa morfologia e aspetto

o Coltura mista= colonie di organismi diversi ->diversa morfologia e aspetto

o

Per identificazione batterica in modo pratico e veloce:

• Micrometodo: galleria->striscia di plastica di 20cm con cupole cave e dentro substrati

differenti; ogni cupola saggi biochimici differenti; interpreto sviluppo di colore (indicatori

che variano colore in base pH)

• Sistema automatizzato: saggi biochimici rilevabili con lettura di fluorescenza; card con

saggi biochimici. Substrato basato su fluoroforo che emette fluorescenza

Tassonomia= scienza che mette in ordine e fa classificazione

Sistema di classificazione tassonomica->ogni categoria riunisce gruppi livello inferiore in base

caratteristiche condivise

• Dominio

• Phylum

• Classe

• Ordine

• Famiglia

• Genere

• Specie->denominazione segue nomenclatura binomiale Linneo

Manuale di Bergey=raccoglie tutti microrganismi con tutte caratteristiche

Metodi usati in tassonomia:

Microbiologia 23/24 Naomi Rinaldi

• Analisi caratteri fenotipici: saggi biochimici, analisi microscopio

Valuto:

Morfologia: es. Colorazione di Gram

o Nutrizione e fisiologia: valuto metabolismo energetico (metodi biochimici)

o Motilità: tipo di movimento

o

• Analisi caratteri biomolecolari: analisi biomolecolari (tecniche moderne)

Valuto:

FAME: analisi acidi grassi

o -Coltura batterica pura

-Estrazione acidi grassi mediante idrolisi->modifica in esteri metilici, composti volatili

analizzabili con gas cromatografia

Lavorare in condizioni standard

Ibridazione DNA-DNA

o -2 microrganismi->estraggo DNA cromosomale

-frammentazione DNA, uno dei 2 marcato con fosforo radiattivo

-aumento T=>denaturo doppie eliche->eliche singole

-miscelo DNA denaturato e DNA denaturato non marcato

-misuro livello di radiattività: se ibridazione 100% stesso microrganismo; se

ibridazione tra 100 e 75% stessa specie; se ibridazione tra 75 e 25% stesso

genere ma diversa specie; se ibridazione <25% generi differenti

Orologi molecolari

o *vedi appunti precedenti*

3 orologi molecolari:

geni che codificano sub. Minore rRNA

▫ ATPasi

▫ geni che codificano RecA

▫

rRNA

Guardo componenti variabili->accumulano mutazioni senza alterare funzione=> info in

ambito identificativo

-primers che riconoscono sequenze conservate

-amplificati fatti migrare su gel d’agarosio

-amplificazione dà frammenti di dimensioni uguali, cambia sequenza nt delle regioni

variabili

-sequenziamento dell’amplificato

-2 indagini:

--capire specie di appartenenza: sequenza ottenuta nel db, % omoogia con specie già

nel db (se >97% stessa specie)

--rapporto di tipo evolutivo: analizzare e confrontare microrganismi->analisi su

modelli matematici

Rapporto GC

o Nei procarioti alta variabilità GC rispetto piante o animali

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Rapporto differisce>5%->no vicini dal punto di vista genetico

Stessa % non vuol dire stessa specie

Rapporto differisce<5%->possono appartenere alla stessa specie

Stessa specie se:

• Ibridazione DNA-DNA >75%

• Rapporto GC < 5%

• Similarità 16S rRNA >97%

Tipizzazione anche nella stessa specie->ceppo:

• Sierotipo: variante sierologica

• Biotipo: variante biochimica

• Morfotipo: variante morfologica

• Patotipo: variante in induzione patologia

• Fagotipo: suscettibilità a batteriofagi

METABOLISMO PROCARIOTI

Concetti legati al metabolismo:

• ATP: adenosina trifosfato

Trasportatore universale di energia libera

Struttura chimica: adenina+zucchero a 5C+3 gruppi fosfato

Connettore tra reazioni anaboliche e cataboliche

ATP usata attraverso la sua idrolisi in ADP che libera energia

ATP si forma per:

fosforilazione a livello del substrato= trasferimento gruppo fosfato da composto

o intermedio con alta energia a ADP per ottenere ATP=>coinvolge intermedi a alta

energia

Fosforilazione a livello di membrana (catena di trasporto elettroni)

o Tipo di via usatannei processi metabolici:

-fosforilazione ossidativa

-fotofosforilazione (tipica fototrofi)

Catena di trasportatori: donatore primario elettroni (fonte di energia) + substrato

Donatore viene ossidato=>elettroni passano da lui a trasportatore in forma ossidata

che verrà ridotto

Trasportatore ridotto passa elettroni a secondo trasportatore ossidato che verrà

ridotto

Ecc. Finché elettroni passati a accettore finale (ossigeno o molecole) che verrà ridotto

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Catene di trasportatori diverse tra microrganismi e diverse dentro stesso

microrganismo->microrganismo può usare trasportatori diversi in base a ambiente o

substrati

Oltre al trasporto di elettroni alcune componenti trasportano protoni->membrana

impermeabile a protoni->gradiente protonico e forza protonmotrice sfruttati da cellula

per produrre ATP

Tipo di accettore finale determina tipo di respirazione:

-accettore finale ossigeno->respirazione aerobica

-accettore finale non ossigeno->respirazione anaerobica

• Potere riducente: NADH e NADPH

Accettori temporanei di elettroni

NAD+ si riduce a NADH e NADP+ si riduce a NADPH

NAD+: adenina+2 ribosio+1 nicotinamide

Quando NAD+ acquisisce 2 protoni e 2 elettroni si riduce a NADH + H+

Potenziale di riduzione= capacità di sostanza di cedere elettroni

Più potenziale di riduzione <0 più specie tende a cedere elettroni (specie riducenti)

Più potenziale di riduzione >0 più specie tende a acquisire elettroni (specie ossidante)

Elettroni fluiscono da specie riducenti a specie ossidanti

• Precursori metabolici: molecole organiche usate per costruire macromolecole

Precursori per tutti i processi di biosintesi

Es. Glucosio-6-P, fruttosio-6-fosfato...

VARIABILITA’ DELLE REAZIONI CATABOLICHE

Denominazione microrganismi in base substrati energetici

Chemiotrofi: usano sostanze chimiche come donatori di elettroni

• Chemiorganotrofi: sostanze organiche-> in base accettore finale aerobi, anaerobi o

fermentazione

• Chemiolitotrofi: sostanze inorganiche-> in base accettore finale aerobi o anaerobi

Fototrofi: usano energia luminosa e la convertono in energia chimica

• Fotosintesi ossigenica (es. Cianobatteri)

• Fotosintesi anossigenica (es. Batteri verdi e rossi)

In entrambi i casi forma di energia ATP che accoppia vie cataboliche e anaboliche

Chemiorganotrofi

FERMENTAZIONE->chemiorganotrofi

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Non usano una catena di trasporto di elettroni, ma ottengono ATP con fosforilazione a livello di

substrato

Fermentazione Respirazione

Substrato organico Substrato organico o

inorganico

Parziale ox substrato=>si Ox completa substrato=>si

ottiene poca energia ottiene tanta energia

Accettore interno (intermedio Accettore esterno

catabolico) (catena di trasporto)

ATP prodotto per ATPprodotto per

fosforilazione substrato fosforilazione ossidativa e

fosforilazione substrato

Ambiente anaerobico Ambiente aerobico o

anaerobico

Es. Fermentazione glicolisi:

1. Sostanza organica: zucchero glucosio (ma anche aa., acidi organici, cc.)

2. Sostanza organica ox e cede elettroni a cofattore NAD+ che si riduce a NADH +

formazione di ATP da fosforilazione substrato

3. NADH cede elettroni a accettore interno->va a ridurre composto organico ox

4. Si riottiene NAD+ e composto organico ridotto

5. Prodotto finale per microrganismo scarto ma per noi importanti in ambito alimentare

(es. Bevande alcoliche)

Diverse tipologie di fermentazione:

-omolattica: prodotto finale acido lattico-> resa netta: 2ATP+2 acido lattico+0NADH

-alcolica: prodotto finale etanolo-> resa netta: 2ATP+2 etanolo+2CO2+0NADH

Fermentazioni si possono innestare su queste vie cataboliche:

• Glicolisi o via di Embden-Meyerhof-Parnas

Glucosio convertito a acido piruvico

Non richiede ossigeno

Potere riducente: ATP, NADH, fosforilazione substrato e precursori

10 reazioni in 2 fasi:

Fase preparativa: consumo ATP per attivare molecole

o -glucosio->glucosio-6-P + spesa di 1ATP

-isomerizzazione: glucosio-6-P->fruttosio-6-P

-fruttosio-6-P->fruttosio-1,6-P + spesa 1ATP

-aldolasi: fruttosio-1,6-difosfato->2 molecole a 3C (G3P, diidrossiacetone fosfato)

-isomerizzazione: diidrossiacetone fosfato->G3P

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Alla fine, ho: 2 G3P + consumo di 2ATP

Fase conservativa: produzione NADH, ATP e precursori metabolici

o -2 G3P ox e aggiunta P->2 1,3-difosfoglicerato + liberazione 2NADH

-2 1,3-difosfoglicerato->2 3PG + 2ATP

-2 3PG->2 2PG

-2 2PG->2 fosfoenolpiruvato

-2 fosfoenolpiruvato->2 piruvato + 2ATP

Alla fine ho: 2ATP, 2NADH, 2 piruvato

• Via di Entner-Doudoroff

Produzione di piruvato da glucosio (substrato di partenza)->da glucosio a glucosio-6-P

spesa 1ATP

Da glucosio-6-P a 6-fosfogluconato produzione 1NADH

Da 6-fosfogluconato perdita 1H2O, formazione KDPG

Da KDPG a piruvato+G3P grazie a aldolasi

Da G3P a piruvato grazie a enzimi di via glicolitica

• Via dei pentoso fosfati

Formazione di intermedi pentosi (5C)

Produzione di NADH utilizzabile da vie biosintetiche

No produzione piruvato ma G3P poi altre vie per ottenere piruvato, ATP, NADH

Variabilità catabolica tra specie diverse e organismi della stessa specie

Fermentazione= reazione di ossidoriduzione equilibrata internamente; no resa netta di potere

riducente; ATP da fosforilazione a livello del substrato (no completa ox); resa energetica bassa

No ossigeno=>anaerobi facoltativi, anaerobi

Substrati: zuccheri, aa, acidi organici...

• Fermentazione lattica

Omolattica: prodotto di scarto acido lattico

o Si innesta su glicolisi; da zucchero glucosio, ox a 2piruvato

2piruvato accettore interno elettroni scaricati da NADH prodotto durante glicolisi

2piruvato ridotto da NADH a 2acido lattico

Batteri