Microbiologia e profilassi delle malattie infettive

PROCEDURE PER LO STUDIO DEI MICRORGANISMI

Molto spesso è necessario crescere i microrganismi in laboratorio per poi identificarli e quantificarli. Queste procedure sono particolarmente importanti anche nell'ambito della farmacologia poiché è richiesto, dalle varie farmacopee internazionali, che ci sia un'esclusione di contaminanti microbici nei farmaci. Queste procedure servono poi per eseguire controlli microbiologici nelle acque fornite dal sistema idrico, negli alimenti, per la diagnosi di infezioni e nell'industria cosmetica, che ha dei requisiti molto stringenti.

Strategie per rilevare e identificare microrganismi

Per quanto riguarda la strategia microbiologica tradizionale, il primo step, sia che si parta da un campione biologico piuttosto che da un prodotto farmaceutico o cosmetico, è quello della coltivazione dei microbi, svolta in maniera tale da ottenerne una coltura pura. Successivamente si passa all'identificazione, tipicamente svolta

mediante analisi microscopica previa colorazione e test biochimici e/o molecolari. In alternativa si potrebbero usare procedure molecolari che risultano più veloci e più economiche. Tuttavia, ricercare una popolazione microbica mediante tecniche molecolari molto spesso porta ad una sovrastima. Le tecniche molecolari infatti ricercano esclusivamente il DNA e la presenza di DNA batterico non è indice necessariamente di una colonizzazione del materiale. Colture batteriche Coltivare microbi significa fornire loro tutti i nutrienti di cui necessitano e regolare fattori fisici quali pH, temperatura, disponibilità di acqua e di ossigeno e pressione osmotica, fondamentali per la crescita batterica. I terreni di coltura sono quindi supporti sintetici forniti al microbo che contengono tutto il necessario per permetterne la crescita. Per ogni microrganismo ci sono terreni con caratteristiche e nutrienti differenti. In un terreno di coltura devono esserci inoltre 6 elementi che

Sono richiesti in grande quantità da tutti gli organismi viventi: carbonio, idrogeno, ossigeno, azoto, zolfo e fosforo (CHONPS). Devono poi essere presenti degli elementi in traccia quali Zn, Mo e Mn, fondamentali per i sistemi enzimatici batterici, e sali minerali (Ca, Fe, Mg, K). Alcuni batteri, come quelli intestinali, hanno esigenze nutrizionali molto elementari per cui sono sufficienti terreni di coltura molto semplici. Al contrario altri microrganismi, detti fastidiosi, richiedono aggiunte quali sangue di animale da cui estraggono fattori essenziali per la loro proliferazione.

Terreni di coltura: suddivisione in base a stato fisico

I terreni di coltura possono essere liquidi, detti dal punto di vista tecnico brodi di coltura (es. terreno al tioglicolato FTM), o solidi, resi tali dall'aggiunta di agar, una molecola zuccherina estratta da un'alga. L'agar si trova in stato solido a temperatura ambiente mentre, a temperatura superiori a 40°C

passa in forma liquida. Per la preparazione di un terreno di coltura solido generalmente si prepara un brodo di coltura, gli si aggiunge una quantità determinata di agar allo stato solido e si sterilizza. Alle temperature di sterilizzazione l'agar si scioglie e quando si raffredda intrappola al suo interno il liquido del brodo formando una struttura con una consistenza compatta simile ad una gelatina.

A.A. 2022-2023 Microbiologia e Profilassi delle Malattie Infettive

Terreni di coltura: suddivisione in base a composizione

I terreni di coltura solidi o liquidi possono essere di due tipi: sintetici o complessi.

Nel caso dei terreni di coltura sintetici, o definiti, la composizione è stata definita in maniera analitica. Si sa in maniera precisa cosa c'è dentro e la concentrazione di tutte le componenti. Questi terreni, essendo molto costosi, non sono quasi mai utilizzati, soprattutto nei laboratori di analisi.

I terreni di coltura complessi hanno una composizione

chimica non ben definita: derivano da prodotto di scarti di lavorazione della carne o di piante che forniscono nutrienti in grande quantità (proteine, lipidi e acidi nucleici). La concentrazione dei nutrienti non è nota per cui il problema dei terreni complessi è la variabilità da lotto a lotto. Terreni di coltura: suddivisione in base alle caratteristiche nutrizionali I terreni di coltura possono essere suddivisi sulla base delle loro caratteristiche nutrizionali: - Terreno minimo: sono molto economici, non supportano molto la proliferazione microbica; - Terreno povero; - Terreno ordinario: permette la crescita di gran parte dei microbi; - Terreno per microrganismi esigenti: addizionati di fattori di crescita; Terreni di coltura: suddivisione in base alla funzione I terreni di coltura possono essere suddivisi anche in base alla loro funzione. La composizione di questi terreni è modificata aggiungendo o rimuovendo nutrienti in maniera tale daindirizzare la crescita microbica nella maniera più affine al nostro obiettivo. Si possono avere terreni non selettivi che consentono la crescita di qualsiasi microrganismo che viene seminato, soprattutto se si ha a che fare con campioni in cui potenzialmente ci sono moltissimi microrganismi (es. feci, tampone cutaneo). Un esempio di terreni non selettivi sono l'agar sangue e l'agar cioccolato, entrambi trattati con il sangue. I due terreni si differenziano tuttavia nel modo in cui il sangue viene trattato: nell'agar sangue i globuli rossi vengono conservati integri nella piastra, il sangue (di pecora o più raramente di cavallo) viene aggiunto al terreno che è quasi solidificato (attorno ai 37°C), nell'agar cioccolato il sangue viene aggiunto quando il terreno è ancora caldo per cui i globuli rossi si rompono e l'emoglobina si denatura. Nel caso dell'agar sangue i batteri devono essere in grado di rompere i globuli rossi per

Accedere ai nutrienti, nell'agar cioccolato i nutrienti sono già disponibili nel terreno. I terreni più utilizzati in laboratorio, anche per verificare la contaminazione di farmaci, sono i terreni selettivi o i terreni differenziali. I terreni selettivi presentano delle aggiunte che consentono la crescita soltanto di alcuni microrganismi. Ad esempio si possono aggiungere antibiotici che uccidono tutti i batteri Gram- permettendo la crescita selettiva dei soli Gram+ (o viceversa). I terreni differenziati presentano delle aggiunte per cui le colonie assumono morfologie particolari, permettendo di differenziare una tipologia dall'altra.

Esempi. Il terreno MacConkey Agar è un terreno selettivo e differenziale che presenta al suo interno dei sali biliari, che uccidono i Gram-, e coloranti (cristalvioletto) che hanno attività antimicrobica verso i Gram+. I batteri che crescono su questa tipologia di terreno sono quindi esclusivamente batteri Gram- che si sono

adattati a vivere nell'intestino (enterobatteri). Il terreno Mac Conkey è tipicamente utilizzato per campioni fecali o nel caso di infezioni da parte di Gram- nelle vie respiratorie (generalmente sono batteri che provengono dall'intestino). Al terreno Mac Conkey si può aggiungere anche lattosio: se i batteri possiedono enzimi per fermentare il lattosio produrranno dell'acido determinando un cambiamento del pH del terreno per cui le colonie saranno di colore rosa intenso. Se i batteri non degradano il lattosio le colonie rimarranno incolori. Un altro terreno selettivo è il Mannitol Salt Agar che permette di selezionare lo stafilococco aureo, un batterio presente solitamente sulla cute, che può causare importanti infezioni. È molto importante, se va verificata l'eventuale contaminazione di prodotti farmaceutici escludere la presenza di stafilococco aureo. Questo terreno.

presenta un alta concentrazione salina e di mannitolo: lo stafilococco aureo è l'unico batterio Gram+ che riesce a sopravvivere e a crescere in presenza di un'alta pressione osmotica.

L'immagine rappresenta una piastra agar sangue su cui sono state seminate più tipologie di batteri che sono in grado di modificare l'integrità dei globuli rossi, eventualmente distruggendoli, provocando quella che si chiama emolisi. Alcuni batteri producono tossine che distruggono i globuli rossi creando delle zone in cui il terreno diventa trasparente, altri al contrario non sono in grado di distruggere i globuli rossi per cui crescono sul terreno senza alterarlo, altri batteri ancora invece modificano in parte la struttura dell'emoglobina rendendola verdastra per cui le colonie assumono colorazione verde.

In questa piastra sono presenti: streptococchi alfa emolitici (A), bacilli gram-negativi (B), streptococchi beta-emolitici (C) e stafilococco aureo (D).

I terreni di

Arricchimento sono terreni ai quali sono aggiunti dei fattori che favoriscono la crescita di determinati microrganismi nell'ipotesi che siano presenti in scarso numero e quindi siano difficilmente isolabili.

Fattori fisici ed ambientali che influenzeranno la crescita batterica:

• A prescindere dalla sua tipologia, il terreno deve essere posto nelle condizioni ottimali di crescita: è necessario controllare il pH del terreno e la temperatura, l'umidità e la tensione di ossigeno dell'incubatore nel quale vanno poi inserite le piastre.

Isolamento di batteri da un campione (coltivarli per ottenere una coltura pura):

Partendo da campioni biologici, o da prodotti di cui si sta verificando la sterilità, è possibile trovare nella piastra colonie di morfologie diverse. Per poterle identificare e caratterizzare al meglio queste colonie devono essere ottenute in coltura pura. Queste diverse colonie vanno quindi recuperate con anse sterili e seminate in piastre.

Differenti eseguendo la diluizione.

Metodi di identificazione dei microrganismi

Una volta isolati i microbi è necessario identificarli precisamente. L'identificazione avviene in fasi successive: tipicamente si procede prima alla colorazione della colonia e poi si procede all'identificazione vera e propria con metodiche biochimiche o molecolari.

Le procedure per le colorazioni sono abbastanza semplici e solitamente fanno ricorso all'osservazione al microscopio ottico a luce trasmessa (solitamente ingrandimento di x100). Con il microscopio si va ad osservare un campione disperso su un vetrino porta oggetto (lasciato asciugare) e colorato. Il materiale che si può esaminare è estremamente variabile: si possono esaminare campioni biologici (espettorato, pus, liquor, sangue, urine) ma anche colonie da piastre. Il materiale viene fissato utilizzante varie metodiche. La metodica più comune è il calore ma si possono anche usare metodi chimici.

fissazione tipicam