Microbiologia

BIOCHIMICHE

ANTIGENICHE

MOLECOLARI

TECNICHE BIOCHIMICHE = si basano sulla alterazione della capacità: di metabolizzare

specifici carboidrati, di produrre specifici enzimi, di produrre specifici prodotti metabolici.

Attualmente vengono prevalentemente utilizzati sistemi automatici.

TECNICHE ANTIGENICHE = dove avremo le reazioni di agglutinazione, saggio

immunoenzimatico, reazione di immunofluorescenza:

▪​ REAZIONI di AGGLUTINAZIONE = campione viene incubato con una sospensione di

particelle di lattice, ricoperte di anticorpi specifici per antigene (capsulari) dello specifico

microrganismo che dobbiamo identificare. Interazione tra anticorpi e antigeni causa

un’immediata reazione di agglutinazione visibile ad occhio nudo.

▪​ SAGGIO IMMUNOENZIMATICO = presenza di un antigene viene rivelata mediante un

anticorpo legato ad un enzima in grado di catalizzare una reazione cromogene in seguito

all’aggiunta di un substrato.

▪​ REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA = rivelazione di antigeni microbici specifici,

mediante anticorpi monoclonali. Esempio: ricerca di antigeni mediante immunofluorescenza

che usa anticorpi specifici.

TECNICHE MOLECOLARI = un metodo specifico e sensibile per identificazione dell’agente

patogeno, si basa sulla ricerca di caratteristiche, ovvero di sequenze geniche del DNA

mediante: amplificazione genica, ibridazione con una “sonda” ovvero una sequenza di acido

nucleico a singolo filamento complementare la sequenza “target”. Un altro metodo è quello

della caratterizzazione proteomica.

Amplificazione genica = permette amplificare una determinata sequenza in modo tale da avere

al termine dei cicli di amplificazione una quantità di DNA tale da poter essere rilevato ad es.

tramite uso di sonde marcate.

Si può fare IBRIDAZIONE IN SITU = tramite “sonda” ossia una sequenza di acido nucleico a

singolo filamento RNA o DNA, complementare rispetto la sequenza di “target” che viene

ricercata in uno specifico patogeno.

IDENTIFICAZIONE PROTEOMICA = caratterizzazione proteomica mediante strumenti che

sfruttano la spettrometrica di massa con tecnologia MALDI-TOF. Si vanno identificare i batteri e

miceti in pochi minuti e sicuramente è un processo che ha maggiore accuratezza rispetto alla

identificazione biochimica

Importante è anche ANTIBIOGRAMMA = dove capiamo se microrganismo è sensibile o

resiste, e ciò si fa attraverso i test (test di diffusione su agar). Partendo dalla colonia si va a

fare una sospensione batterica e si va determinare concentrazione della sospensione

batterica, dopo aver definito la concentrazione si va ad effettuare una semina su tutta la

piastra, che in contemporanea vengono posti dei dischetti che contengono gli antibiotici.

Mettiamo tutto ad incubare in un termostato, e dopo 24h si vanno vedere i risultati.

- MICRORGANISMO SENSIBILE = se siamo in presenza di alone di inibizione che è = 1mm

- MICRORGANISMO INTERMEDIO = efficacia dell’antibiotico non è ben definita, indica un

effetto terapeutico incerto

- MICRORGANISMO RESISTENTE = batterio cresce intorno all’antibiotico e non viene

bloccato. Se utilizziamo questo antibiotico in un pz, probabilmente la terapia non funziona.

Si hanno delle strumentazioni che eseguono questi ANTIBIOGRAMMI, che permettono

l’identificazione ma anche se un batterio è resistente o meno ad un antibiotico.

DIAGNOSI INDIRETTA = in alcuni casi non è sempre possibile svolgere questa diagnosi (es:

pazienti con scarsa risposta immune) e in questi casi non si può fare l’antibiogramma.

RISPOSTE ANTICORPALE:

primaria = è quella che avviene dopo pochi giorni, raggiungono l’apice verso la 3°

settimana, per poi scomparire. In questa fase l’organismo produce linfociti B della

memoria, che conservano il ricordo dell’incontro con antigene. Tipologia di anticorpi

presenti nel campione:

―​ IgM = transitorie e indicative di una infezione primaria e recente (compaiono pochi giorni

dopo l’infezione)

―​ IgG = compaiono più tardivamente

STAFILOCOCCHI (cocchi Gram +) = crescono a grappolo d’uva, sono: immobili (non hanno flagelli), non

formano spore, sono generalmente capsulati, sono anerobi, sono alofili che crescono in presenta di alte

concentrazioni di clorulo di sodio.

Genere = STAFILOCCOCUS.

- Sono caratterizzati nel poter crescere in un ampio range di temperatura, riescono a

sopportare anche ad un ampio range di pH. Colonie che formano nei terreni sono: netti,

convesse, con pigmentazione aurea, bianca. Reazioni enzimatiche sono: catalasi+, ossidasi- e

possono presentare la coagulasi +/- a seconda della specie.

- Comprende molte specie e sono presenti nelle mucose e nella cute e sono chiamati patogeni

opportunisti e possono causare un grande range di infezioni più o meno gravi.

Specie più comuni che causano infezioni:

- stafilicoccus edidermidis

- stafilicoccus haemolyticus

- stafilicoccus saprophyticus

- stafilicoccus aureus = nome deriva da colorazione di colonie gialla-oro, che compare quando

cresce nell’agar sangue, produce coagulasi che lo distinguono da altri stafilococcus. È uno

stafiloccocus coagulasi +.

PARETE:

FATTORI DI VIRULENZA = è una misura quantitativa della patogenicità.

Stafilococco ha molti fattori di virulenza che sono: tossine, enzimi, componenti strutturali.

COMPONENTI STRUTTURALI:

- capsula = esterna, di natura polisaccaridica, ha azione anti-fagocitaria, inibisce chemiotassi.

- adesine = strutture che permettono adesione del microrganismo ai tessuti dell’ospite e alle

matrici intercellulari, sono molte. Tra di esse è compresa la coagulasi legata.

- proteina A = va coprire superficie del batterio e va a legarsi con anticorpi, impedisce

opsonizzazione e la fagocitosi, ha anche funzione antigenica.

TOSSINE:

- Citotossine = hanno azione citolitica (citossina alfa, beta, delta, gamma).

- Tossine esfoliative = causano esfolazione, sono 2: termostabile e termolabile. Sono

responsabili della sindrome di cute scottata e malattia di Ritter (dermatite esfoliativa)

- Enterotossine = causano diarrea, agiscono su gli enterociti, hanno funzione di super antigene

che vanno stimolare la proliferazione di linfociti T e vanno stimolare anche rilascio di citochine

- Tossina che causa lo shock tossico = causa la morte, ha funzione di super antigene che

vanno a stimolare la proliferazione dei linfociti T e vanno a stimolare anche rilascio di citochine

ENZIMI:

- Coagulasi = trasforma fibrinogeno in fibrina che deve reagire con un co-fattore plasmatico,

nel coagulo di fibrina, batteri saranno protetti da fagocitosi.

- Fibrinolisina = dissolve coaguli di fibrina, permette trasformazione di plasminogeno,

favorendo così diffusione ematica del batterio.

- Catalasi = scinde perodìssido di idrogeno, protegge batterio da killing mediato da fagociti

- Ialuronidasi = serve a diffondere attraverso il tessuto

- Lipasi = va scindere lipidi, permettere crescita e diffusione nelle aree sebacee

- Nucleasi = permettono fluidificare materiale purulento, e favorire diffusione di batterio

- Penicillasi = idrolizza anello beta-lattamico di penicillina

Strafiloccocus Aureus = si chiama così perché produce le colonie auree, lo troviamo sulla

cute, a livello delle pieghe cutanee umide, sulle mucose del tratto gastrointestinale, nel tratto

urogenitale e, generalmente, stato di portatore è transitorio.

Può causare un gran numero di patologie, e possono essere mediate da tossine (es:

intossicazione alimentare che è dovuta ad una enterotossina che va a contaminare il cibo) e ci

sono le patologie causate dal danno che causa lo strafiloccocus aureus. È molto resistente alla

meticillina ed alle altre penicilline semisintetiche che ormai è molto diffusa. La sua

colonizzazione è transitoria, ma lo ritroviamo a livello nel nasofaringe è molto elevata negli

adulti ma principalmente nell’ambiente sanitario.

ITER x DIAGNOSI di LABORATORIO

- esame microscopico = è un cocco gram+

- esame colturale = possono essere seminati sul terreno agarizzato perché non ha molte

esigenze nutritive.

- identificazione = si fa attraverso test di coagulasi, ma abbiamo pure test di agglutinazione al

lattice con particelle coattate con fibrinogeno e specifici anticorpi anti-S.aureus.

- test di suscettibilità agli antibiotici = si fa antibiogramma per capire se microorganismo è sensibile o

resistente.

STREPTOCOCCHI (cocchi gram +) = hanno forma rotondeggiante e colore violaceo, sono disposti a

catenelle, sono anaerobi facoltativi (crescono sia in presenza che assenza di ossigeno), non formano

spore, sono immobili, sono capsulati, sono catalasi negativi (è importante perché non avendocelo

vengono distrutti da perossido di carbonio).

Crescono su vari tipo di terreno ma quello più utilizzato è l’agar sangue che contiene sangue

sterile defibrinato di cavallo o di montone.

Vengono classificati in base:

- Caratteristiche emolitiche = ovvero che antigeni hanno e sono suddivisi in: beta- emolitici

(causano emolisi completa), alfa-emolitici (causano un’emolisi parziale) e gamma-emolitici

(non causano emolisi).

- Proprietà antigeniche = al livello della parete presentano un polisaccaride chiamato Antigene

C, sulla base del tipo di polisaccaride gli streptococchi sono suddivisi in vari gruppi indicati con

le lettere dell’alfabeto: gruppi di Lancefild.

- Costituiscono gran parte della popolazione microbica e sono presenti: tratto intestinale, parte

orale, faringea ecc.

STREPTOCOCCO PYOGENES = agente eziologico di faringite, è un beta-emolitico.

Possiede un antigene polisaccaridico di gruppo A.

Composto anche da Proteina M, ancorata a membrana citoplasmatica.

È responsabile principale della suddivisione in tipi.

Esistono varie tipologie di Streptococcus Pyogene, in base a variazioni della proteina M.

FORMATI da:

CAPSULA = non è polisaccaridica, è costituita da acido ialuronico e ha azione anti-fagocitaria.

PROTEINA M = responsabile per suddivisione in vari sierotipi ed è un importante fattore di

virulenza, permette l’adesione e inibisce l’azione del complemento

PROTEINA F = serve per far interagire batterio con fibronectina presente nella matrice

intercellulare. È adesina principale del batterio.

TOSSINE = streptolisina s e streptolisina o, tossine pirogeniche, tossina della sindrome da

shock tossico.

STREPTOLISINA S e O = sono cito-tossine (distruggere le cellule, formando dei pori), fanno

l’emolisi.

TOSSINE PIROGENICHE = sono svariate, es. inducono febbre, perché inducono una forte

risposta del sistema immunitario (sono super antigeni), e inducono rilascio di citochine che

sono pirogene e causano la febbre.

TOSSINE DELLA … = causa disfunzione da multi-organo, perciò può