Microbiologia

ESPERIMENTO: RESTRIZIONE E MODIFICAZIONE

Un esperimento che venne considerato all'epoca una curiosità e, come spesso succede quando si

parla di esperimenti in campo microbiologico, questa curiosità si rivelò poi essere una scoperta

estremamente importante; tant’è vero che poi qualcuno ci ha preso il Nobel su queste osservazioni

ed è qualcosa che noi utilizziamo ampiamente.

Era un esperimento che era stato fatto utilizzando dei

batteriofagi di Escherichia coli ed era stato visto questo:

ci sono diversi ceppi di Escherichia coli che differiscono

tra di loro per alcune caratteristiche genetiche e quelli

che sono stati presi in considerazione sono chiamati

Escherichia coli K e Escherichia coli B. I ricercatori avevano osservato che se un batteriofago di

Escherichia coli veniva fatto propagare su Escherichia coli di tipo K, in questo modo infettava con

alta efficienza Escherichia coli K ma infettava con bassissima efficienza (praticamente quasi zero)

Escherichia coli tipo B; al contrario se il virus veniva fatto propagare su Escherichia coli B questo

virus infettava bene il tipo B, mentre invece infettava malissimo o niente Escherichia coli di tipo K.

Dedussero quindi che la crescita di questi virus era ristretta al ceppo batterico su cui erano stati fatti

propagare e che, durante la loro crescita, venivano modificati in modo tale da poter crescere su

questo ceppo ma non su altro.

Lo studio di questo strano fenomeno andò avanti e videro che questo fenomeno era legato alla

presenza, all'interno delle cellule batteriche, di enzimi particolari chiamati enzimi di restrizione:

questi riconoscono una determinata sequenza di DNA e tagliano la doppia elica del DNA. Le

sequenze che vengono riconosciute possono essere più o meno lunghe (4/6/8 paia di basi); quindi si

può immaginare che all'interno di un genoma c’è una certa probabilità di trovare sequenze di questo

genere casualmente.

I virus a DNA che infettano una cellula batterica, inseriscono dentro alla cellula il proprio DNA e,

se porta al proprio interno sequenze a cui si possono attaccare enzimi di restrizione, il DNA viene

riconosciuto e viene tagliato; quindi questi batteriofagi vengono inattivati. Ovviamente questi

enzimi non discriminano tra DNA cellulare e DNA estraneo: tagliano ogniqualvolta trovino la

sequenza che possono riconoscere. Tuttavia, la cellula si protegge perché, per ogni enzima di

restrizione che produce, produce in accoppiata anche un altro enzima chiamato enzima di

modificazione: l'enzima riconosce la stessa sequenza che, invece di tagliarla, la modifica; ad

esempio, in molti casi aggiunge un gruppo metilico alla citosina se è presente nella sequenza

riconosciuta dagli enzimi di restrizione. In questo modo, modificandola, protegge il DNA cellulare.

Questa protezione vale anche se viene modificata una sola delle due eliche, che quindi viene

conservata durante la duplicazione semiconservativa. Se una mutazione inattiva l'enzima di

modificazione, chiaramente la cellula muore; quindi sono mutazioni letali quelle che eliminano

questa attività di protezione. Gli enzimi di restrizione sono alla base di molte tecniche di ingegneria

genetica e sono quelli che hanno consentito ad esempio il clonaggio di sequenze di DNA.

PROCEDURA DI BASE GENERALE DI INGEGNERIA GENETICA:

Prendiamo in considerazione i plasmidi e gli enzimi di restrizione. I DNA

plasmidici sono facilmente purificabili perché sono DNA di dimensioni

ridotte e contenute; il DNA plasmidico può essere modificato come

vogliamo: diventa il nostro vettore e porta al proprio interno un unico sito di

restrizione riconosciuto da un enzima che si chiama EcoR1.

EcoR1 è l'enzima che riconosce una sequenza di 6 paia di basi e la cosa

interessante di questo enzima è che taglia in modo sfalsato; questo vuol dire

che taglia in punti diversi sulle due eliche. Quindi il taglio di un plasmide

circolare porta alla formazione di un DNA linearizzato con estremità

coesive. Nell’immagine c'è un taglio dove ci sono quattro basi a singolo filamento che sono

complementari. Si può prendere poi un DNA di qualunque origine che chiamiamo

DNA donatore a doppio filamento (non è importante da dove

provenga, che sia lineare o circolare), lo tagliamo con lo stesso

enzima, che lo spezzetta in tanti segmenti. Dato che la sequenza

riconosciuta è sempre la stessa, si hanno dei segmenti di varia

lunghezza, tutti con estremità coesive formate dalle stesse

sequenze perché l’enzima è sempre lo stesso.

Si possono mescolare questi segmenti di DNA donatore con il plasmide

vettore che avevamo tagliato e la complementarietà delle basi permette di

formare l’appaiamento mediante le estremità coesive, grazie ai legami a

idrogeno. La struttura può essere consolidata mediante l’enzima ligasi e si

ottiene un plasmide integro che porta una sequenza di DNA estraneo

oltre a quello plasmidico (DNA ricombinante).

Sono plasmidi che hanno la capacità di riprodursi in Escherichia coli e

quindi vengono reinseriti dentro alle cellule. Escherichia coli è uno di quei

batteri che in natura non può essere trasformato, ma lo si può trasformare

artificialmente. Alla fine si ottiene che il tratto di DNA, che noi abbiamo

clonato nel plasmide, è stato amplificato un numero di volte estremamente

elevato.

Questa è la tecnica di base di ingegneria e c’è da notare che osservazioni che sembrano quasi

curiosità hanno una ricaduta pratica che è decisamente molto più elevata.

METABOLISMO MICROBICO

I microrganismi si devono riprodurre e utilizzano tutto ciò che hanno a disposizione grazie al

proprio metabolismo. Nel mondo dei microrganismi ci ritroviamo vie metaboliche che non sono

disponibili negli altri organismi (come piante e animali). Queste vie metaboliche vanno bene per le

cellule, ma molte di queste si possono sfruttare anche per le attività umane: ad esempio il

formaggio, il vino o la birra sono prodotti dell'attività metabolica di alcuni microrganismi.

Cosa si intende quando parliamo di metabolismo?

Il metabolismo è una descrizione di tutte le reazioni chimiche che avvengono all'interno di una

cellula vivente; questa è una definizione generale del metabolismo per qualunque organismo.

Queste vie metaboliche possono essere di due tipi:

- CATABOLISMO: dove abbiamo una degradazione dei prodotti per produrre e conservare

energia all’interno della cellula;

- ANABOLISMO: è l'altra via diametralmente opposta ed è la via biosintetica, dove abbiamo la

sintesi di molecole più o meno complesse a partire da molecole semplici. Questa via metabolica

consuma energia perché è una via biosintetica, cioè di sintesi.

Quindi possiamo dire che il catabolismo ci genera l'energia necessaria per le reazioni anaboliche;

ovviamente, l'energia viene utilizzata anche per altri processi all'interno della cellula ma, a livello

del metabolismo, una via o è catabolica o è anabolica.

Questa è una molecola di ATP (adenosinatrifosfato), una

molecola estremamente importante perché ci sono due

legami fosforici, indicati come legami anidridici, che sono

legami alta energia, cioè la formazione di questi legami

richiede un’energia elevata e allo stesso tempo la loro

scissione libera energia → è la benzina delle attività

metaboliche all'interno della cellula; sarà la molecola che

principalmente immagazzinerà l'energia liberata dai processi catabolici e sarà la moneta di scambio

che fornirà energia nei processi anabolici.

Quindi ogni essere vivente deve avere all'interno della cellula dei processi metabolici che

producono ATP essenzialmente.

All'interno di una cellula i processi metabolici sono basati su reazioni chimiche: per passare da una

reazione a due substrati A e B a due prodotti C e D che si trovano a un livello energetico inferiore, è

necessario perché avvenga questa reazione un’energia di attivazione (Ea). Più è alta l'energia di

attivazione più è difficile che avvenga questa reazione.

All’interno della cellula, le vie metaboliche fanno queste reazioni chimiche; è necessaria una

energia di attivazione ma la cellula ha un qualcosa in più: possiede delle proteine chiamate enzimi.

Nel grafico in figura, sull’asse delle x è riportato

l'avanzamento della reazione mentre sull’asse

delle y l’energia libera. Per far avvenire la

reazione è necessaria normalmente un’energia di

attivazione che è data da questa curva in rosso; con

gli enzimi passiamo alla curva verde, che ha

un’energia di attivazione notevolmente inferiore

→ gli enzimi facilitano le reazioni chimiche.

Non è che le reazioni chimiche all’interno della

cellula siano totalmente indipendenti dalle regole

della chimica, dato che è necessaria l’energia di

attivazione e c’è anche un effetto della temperatura

sulle reazioni chimiche, per quanto gli enzimi

possano intervenire. La presenza degli enzimi è un

qualcosa che facilita molto questo sistema.

• Modello di chiave serratura:

L’energia di attivazione serve a far mettere le molecole che

devono reagire vicine le une alle altre e nella configurazione

corretta perché possa avvenire la reazione chimica. Nel caso

della reazione chimica normale, tutto ciò è collegato a vari

fattori, tra cui la concentrazione dei substrati che partecipano

alla reazione. Nell’enzima si ha un sito attivo dove sono

presenti siti di legame per il substrato. Le due molecole che si

legano nei siti hanno il vantaggio di essere una accanto

all’altra e bloccate nella configurazione corretta per far

avvenire la reazione. Quindi il problema della concentrazione

dei substrati e della configurazione corretta per la reazione

viene superato. È necessaria una quantità di energia libera

inferiore e in seguito il prodotto si distacca dall’enzima.

CLASSIFICAZIONE DEGLI ESSERI VIVENTI

Le categorie che vengono in seguito prese in esame racchiudono tutti gli organismi viventi; un fatto

interessante è che per alcuni di questi gruppi, gli unici rappresentanti sono i microrganismi (gli

animali e le piante non rientrano in alcuni di questi gruppi).

Due concetti chiave sono la fonte da cui gli organismi viventi prendono il carbonio e come fanno a

generare ATP.

• Gli organismi viventi si possono dividere in base alle fonti di carbonio:

a) Organismi eterotrofi: usano come fonte di carbonio molecole organiche già sintetizzate e

sono solo capaci di trasformarle; non sono capaci di produrle ex novo.

b) Organismi autotr