Medicina trasfusionale ed ematologia

assionale

medicina

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emalga

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Due aree di conoscenze:

1. Acquisizione di conoscenze culturale, informazioni, nozioni, comprensione del meccanismo biologico del sistema (cosa sta alla base).

2. Applicazioni pratiche, cliniche, gestioni del malato.

Due aspetti importanti da distinguuee:

1. Ricerca di segni del pz (segni obiettivi)

2. Ricerca dei sintomi (che il pz riferisce) => esigenza di approfondire, perché il pz potrrbbe non riferirli (selezione di censura)

la variabile temporale degli eventi, coordinata temporale

La stessa cosa può succedere in modo improvviso, subacuto, oppure in modo talmente dilazionato nel tempo, disperso nella coordinata del tempo, che

quasi si fa fatica a capire quando è iniziato questo fenomeno…

MA è molto importante dare una condizione temporale di tale fenomeno: nell’interpretazione di un quadro clinico, cambia soffrire da una vita o

acutamente, con ostacoli nella vita quotidiana.

L’interpretazione del fenomeno clinico nella sua coordinata temporale è importantissima

!!! Serve un approccio massivamente clinico (nell’assistenza sanitaria in generale)

La standardizzazione

Si studia nell’ottica di impostare la propria attività in modo standardizzato —> vantaggio = si ha un riferimento, una sequenza di azioni.

Es: medicare un punto di inserzione di un cvc. Infettare un punto d’ingesso vuol dire mettere a rischio la vita del pz. L’approccio standardizzato a certe

procedure ha l’enorme vantaggio di essere sereno di avere un punto di riferimento: si ha la certezza di star facendo le cose giuste.

L’esperienza poi permetterà non solo di metterci del tuo, ma anche di elaborare con la prorpia intelligenza soluzioni diverse allo stesso problema.

Ma deve essere condotto tutto secondo un rigore deontologico, ordinato, metodico.

—> la standardizzazione è la via più corretta per l’innovazione: migliorare presuppone chiarezza e metodo rispetto al lavoro standard.

Il progresso avviene attraverso il progresso degli standard.

emopoiesi

Il SANGUE ha una caratteristica importante: è un tessuto che permane nell’organismo e diffonde nell’organismo. Non c’è organo vitale che non riceva il

sangue, anche l’osso (!!! Nell’osso spugnoso c’è il midollo osseo).

—> la funzione del sangue è una funzione che è rilevante per TUTTI gli organi = trasportare/rendere accessibile a tutti gli organi e tessuti due grossi

elementi: ossigeno (= E, comburente che serve per produrre energa) e nutrienti (di vario tipo, elettroliti, glucidi, lipidi, proteine, acqua, sali, ormoni…): è un

veicolo di comunicazione, trsporto, di tutto ciò che serve ai tessuti per mantenere l’omeostasi, quindi equilibrio.

= fornire energia e garantire omeostasi.

Senza l’ossigeno, ci sono cellule che non riescono a sopravvivere nella loro funzione per pochi secondi, anche per frazioni di secondo. Es ipotensione

ortostatica: i neuroni della corteccia non ricevono O2 a sufficienza per il calo di pressione imposto dal cambiamento di posizione e non viene pompato

abbastanza o2.

Il sangue è fatto, grossolanamente, da due componenti:

1. fluida = plasma = mix di acqua, cloruro di sodio NaCl (concertazione 0,9x1000 = fisiologica), zuccheri, lipidi, proteine! (studiate mettendole su un gel

e facendo correre quelle proteine in un campo elettroforetico —> viaggino sul gel atttratte dal polo positivo e si spalmano nel gel in funzione della

loro capacità di essere attratte, polarizzate => frazioni che si identificano = albumina, globulina alfa 1/beta 1/gamma), aa, ormoni circolanti (Es. fattori

di crescita), ioni e sali. Tra le proteine che contiene ci sono i fattori della coagulazione = quando si attivano, parte la cascata coagulativa, si forma la

deposizione di fibrina => coagulo, che intrappola gb, piastrine e gr.

2. Cellulare = componente corpuscolata: galleggiano nella parte liquida, ragione per cui il sangue, quando privato dalle cellule, è tendenziamente

giallognolo. La torbidità (perdita di afania) è dovuta ai trigliceridi (motivo per cui ai prelievi bisognerebbe essere a digiuno).

Il sangue ha quindi una caratteristica di fluidità. Quando si ferma, si ferma perché evidentemente la sua struttura cambia fluidità (oppure trova uno stop , es

coagulo).

Le cellule galleggiano e scorrono nel plasma, che tende ad essere vorticoso (=> sospensione particelle, che rischiano di non continuare col flusso, ma

rimanere sospese).

I granulociti e i neutrofili rimangono adesi al vaso, scorrono sulle pareti = quota marginale. Con il cortisolo endogeno si staccano e vanno nel torrent

circolatorio.

Il sistema emopoietico è un sistema altamente geriarchico.

Vertice = cellule staminali emopoietiche = cellula staminale totipotente = ha la capacità di dare origine a tutt la progenie di cellule sane, di tipo diverso,

come i globuli rossi o i globuli bianchi.

Globuli rossi = sacchetta di emoglobina

Globuli bianchi = fabbrica di enzimi distruttori

Nel midollo da una cellula staminale possono avere origine progenie di cellule con forma struttura. Funzione completamente divere

La cellula staminale ha la caratteristica di automantenersi: garanzia del fatto che il sistema non si spenga, non si esaurisca.

Ha una divisione cellulare asimmetrica: quando si divide, genera da un lato una staminale uguale a sé stessa e dall’altro una cellula che prende una strada

di differenziazione (= linea cellulare).

1

Verso GR = linea eritroide; verso GB = liena mieloide; verso LINFOCITI = linfoide; verso PIASTRINE = linea megacariocitaria (> megacariociti).

&

Quando viene intrapresa una linea, la cellula non può ritornare a diventare staminale o non può differenziarsi ulteriormente.

Principio per cui si tiene lo stesso numero di staminali: ogni cellula che muore, viene sostituita da una nuova, prodotta dal midollo.

Il meccanismo con cui si producono continuamente nuove cellule è la mitosi.

Non smette mai: non si smette mai di produrre queste cellule. È una catena di montaggio che non si ferma mai.

Piastrine: frammenti cellulari, del citoplsma dei megacariociti. I vacuoli si frammentano, e i frammenti saranno poi piastrine.

Linfociti: prodotti dal midollo osseo. Però poi, a differenza delle cellule mieloidi, circolano nel sangue periferico a hanno organi, gli organi linfoidi (timo,

milza e linfonodi), che sono vere e proprie stazioni di governo del sistema linfoide. I linfociti hanno la caratteristica di essere killer specifii, specializzati: un

linfocita che ha imparato a riconoscere un batterio, uccide solo quel determinato batterio.

I linfonodi e la milza sono il luogo dove avviene l’incontro tra linfociti e il loro antigene: è il luogo dove viene costruita la specificità di queta risposta e si

generano questi linfociti specififi.

Il sistema immunitario innato: i macrofagi fagocitano senza specificità: fagocita contemporaneamente due intrusi diversi. Specifico nel senso che

riconosce cio che è diverso, ma in modo molto più ampio, non è selettivo nei confronti di un patogeno.

Un malato non ha neutrofili che circolano => quando entra un germe nel sangue, questo non ha barriere di difesa. Può avere qualche linfocita, ma non ha la

prima barriera. —> pz che puo andare incontro facilmente ad una setticemia.

chemioterapici

dei

Effetto

Uno degli organi piu sensibii all’effetto dei chemioterapici (molecole che si in lano nel DNA, lo rompono e impediscono a quella cellula di duplicarsi =

morte) è il midollo osseo.

—> con la chemioterapia non si uccidono le cellule mature circolanti nel sangue, ma impatta il midollo emopoietico: colpisce le cellule che duplicano, che

vanno in mitosi, che proliferano.

=> i valori del sangue scendono perché quelle che circolano hanno un emivita massimo, ma non vengono rimpiazzate => piano piano i valori scendono.

Cosa ci permette di recuperare questa discesa poi?

Il midollo si ferma transitoriamente per 2-3 giorni per effetto della chemioterapia (a seconda di dose e intensità). Quando riparte, i valori risalgnono: il

midollo, quando riparte, produce più cellule rispetto al normale.

Si può forzare continuamente questa condizione di recupero con dei farmaci, come i fattori di crescita (gcsf, eritropoietina…), biologici, generalmente

sottocute, che stimolano il midollo a lavorare ancora di più di quello che sta facendo => si stimola a produrre di più, quindi il recupero del valore del

sangue periferico è più rapido.

Ogni giorno di neutropenia assoluta corrisponde al 10% di probailità di avere una febbre neutropenica (setticemia)

=> stimolare il midollo del pz con eritropoietina, ferro e acido folico. fi

MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELL’EMOPOIESI

1. Midollo osseo: embriologia, anatomia, microambiente

2. Fisiologia cellule emopoietiche: albero differenziativo emopoietico, cellule staminali emopoietiche

3. Fattori di regolazione dell’emopoiesi

MIDOLLO OSSEO

Embriologia

All’inizio dell’embrione, il midollo sseo non esiste ancora. L’ematopoiesi avviene in sedi diverse, che cambiano col tempo.

1. Fino alla 6^ settimana = periodo mesoblastico: ematopoiesi soprattutto nel sacco vitellino + AGM (Aort, Gonadi, Mesonefro) = si creano le

cellule staminali del sangue

2. Tra 6^ e 12^ settimana = periodo epatico: il fegato fetale diventa la sede principale della produzione del sangue e le cellule staminali si

moltiplicano e iniziano a differenziarsi meglio.

3. Dalla 12^ settimana = periodo epatosplenico = oltre al fegato, entra in funzione anche la milza:L produzione più organizzata e completa

4. Dalla 20^ settimana no alla nascita = periodo midollare: il miollo osseo diventa la sede de nitiva dell’ematopoiesi + si sviluppano i

meccanismi di homing, che permettono alel cellule staminali di sapere dove andare (devono migrare nel midollo) (! SDF-1 x segnale chimico/

CXCR-4 recettore sulla cellula staminale)

Anatomia

• Midollo giallo = grasso midollare

• Midollo rosso = mielopoiesi attiva; tessuto gelatinoso semi uido, ricco di grasso. Nell’adulto: vertebre, scapole, coste, sterno, bacino, cranio,

estremità prossimali omeri e femori.

Sistema vascolar midollare: rilevanza delle venule post capiullari (HEV), dei seni venosi che circondano gli aggregati (isole di granulopoiesi-

eritropoiesi)

Micoambiente stromale = ruolo non di supporto, ma di regolazione dell’emopoiesi —-> cellule stromali, origine da mesenchymal stem cell.

Interazione stroma-cellule emopoietiche:

• cellule-cellule = integrine

• Cellule-matrice = GAG, bronectina, collagene

• Cellule-molecole regolatorie = fattori di crescita

Microambiente midollare

Matrice extracellulare: collagene, glicoproteine, proteoglicani, elastina, laminina.

Funzione di ancoraggio, di compartimentalizzazione dei fattori soliuili e dunque delle isole di proliferazione e differenzazione specifica.

Immissione delle cellule in circolo = mobilizazione

Cellule mature: perdita dei legami con stoma e matrice

Fenestrature sinusoidali —> citodeformazione con passaggio attraverso pori di migrazione

EMOPOIESI

Schema generale della differenziazione delle cellule emopoietiche

L’emopoiesi è il processo con cui si formano tutte le cellule del sangue (gr, gb, plt) a partire da poche cellule “madri” nel midollo osseo.

Cellula staminale —> cellule sempre più specializzate —> cellule mature nel sangue

CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE HSC= cellule “madre” di tutte le cellule del sangue.

Sono pochissime: 0,005-0,01% delle cellule del midollo osseo.

Di solito stanno “ferme” (in quiescenza, fase G0 del ciclo cellulare).

Hanno due capacità fondamentali:

1. Self-renewal = possono dividersi e produrre altre cellule staminali uguali a sé

2. Commitment = differenziazione = possono trasformarsi in cellule più specializzate

fi fi fl

Devono mantenere un equilibrio:

• se si dividono troppo, si esauriscono

• Se si differeniano troppo, niscono le staminali

Committed progenitor = cellule che non sono più staminali vere. Hanno già “sceltop” che tipo di cellula del sangue diventeranno. Possono ancora

dividersi, ma solo in una direzione.

Esempi (nomi che si vedono nelle colture in vitro):

• CFU-G = granulociti

• CFU-GM = granulocisti + monociti

• CFU-M = monociti

• CFU-MK = megacariocii —> piastrine

• CFU-Eo = eosino li

• BFU- E = globuli rossi (eritrociti)

Precursori midollari = cellule immature, già riconoscibili al microscopio. Vivono nel midollo osseo. Non sono ancora funzionali, ma stanno completando la

maturazione.

Cellula matura = cellula del sangue completamente sviluppata. Esce dal midolllo e va nel sangue

• globulo rosso —> trasporto O2

• Globuli bianchi —> difesa

• Piastrine —> coagulazione

HSC e Surface markers

Le HSC non si riconoscono al microscopio. Si identificano in lab grazie a marker di superficie (proteine sulla membrana cellulare).

Servono per: studiarle in vitro, isolarle, usarle nella ricerca e nei trapianti di midollo

HSC —> progenitori —> precursori —> cellule mature

HSC: ripopolazione midollare dopo trapianto

• riduzione comparto staminle rispetto al normale

• Sbilanciamento verso il committment che garantisce normali conte periferiche

• Nella ct con trapianti seriati: progressivo danno al microambiente midolare con ridotto supporto all’emopoiesi.

HSC: fattori di regolazione

La maggior parte delle HSC è in fase di quiescenza (G0)

La presenza di citochine nel microambiente midollare e il contatto cell-cell con le cellule stromali determina la proliferazione/differenziazione: nel’ipotesi

attuale, ad ogni divisione cellulare viene generata una cellula committed (via differenziativa) e una cellula staminale totipotente (self-renewal)

HSC: citochine regolatrici

Classi:

• colony stimulating factors CSFs: inducono proliferazione e stimolano le proprietà funzionali delle cellule terminalmente differenziate

• Interleuchine (IL3, IL5, IL6, IL11, LIF, SCF): azione sinergistica con CSFs.

Classificazione secondo il livello maturativo delle cellule bersaglio:

1. Fattori speci ci per una linea maturativa

2. Fattori linea non-speci ci che agiscono su progenitori intermedi

3. Citochine che agiscono sul ciclo cellulare dei progenitori più primitivi

Grown factors fi fi fi fi

HSC: regolatori negativi dell’emopoiesi

• proteina in ammatoria macrofagica: MIP-1

• Tumor necrosis factor alfa: TNF

• Interferoni: IFNs

• Transforming growth factor beta: TGF-beta

Azione reversibile, non specifica per linea differenziativa; azione diretta verso progenitori precoci.

HSC: fattori di regolazione intrinsechi

• molecole di segnale (Ras, Jak stat)

• Fattori trascrizionali (HOX, GATA)

• Cell cycle regulatory factors

HSC: mobilizzazione

In fase di emopoiesi “steady-state” le cellule CD34+ sono < 0,001/mcL

Dopo ct + G-CSF il compartimento staminale si espande e viene mobilizzato in sangue periferico sino a conte CD34>20/mcl

Le cellule staminali raccolte da sangue periferico sono più ricche di progenitori committed e di precursori.

fi ematologia

laboratorio di

EMOCROMO, MORFOLOGIA, CITOMETRIA A FLUSSO

Analisi di primo livello (si fanno per prime)

• Emocromo, effettuato da un contatore automatico. Serve per contare e misurare le cellule del sangue (globuli rossi, globuli bianchi e piastrine)

• Morfologia, associata a uno striscio di sangue periferico, tramite microscopio ottico. Sevre per guardare al microscopio la forma e l’aspetto delle

cellule per sangue, tramite lo striscio di sangue periferico (su vetrino).

Analisi di secondo livello (solo se il primo livello mostra qualcosa di anomalo o poco chiaro

• Citometria a usso: cito uorimetro

• Morfologia: striscio di sangue midollare, microscopio ottico

Ematologia molecolare

TIPI DI CAMPIONE

1. Emocromo provetta EDTA (anticoagulante, chelante del calcio: impedisce al sangue di coagulare legandosi al calcio). In alternativa, si possono

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usare provette con eparina (verde) o con sodio citrato (azzurro), ma possono modi care i colori dei vetrini al microscopio.

Possono essere utilizzate tutte e tre per confermare un’alterazione.

1. Morfologia EDTA.

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2. Citometria a usso EDTA, sodio citrato o eparina.

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PREPARAZIONE ALL’ANALISI

1. Emocromo: no.

2. Morfologia: sì, per gestire strisci di sangue periferico colorati con colorazione May-Grünwald Giemsa.

3. Citometria: sì, con miscele anticorpali o lavando/incubando il campione per valutare interferenze speci che (lavato/incubato/lisato/marcato)

Importanza dei dati clinici

Nei test base (emocromo e morfologia) i dati clinici aiutano, sono utili, ma non sono indispensabili.

Mentre nella citometria a usso e nella morfologia dell’aspirato midollare, invece, sono fondamentali per capire cosa si sta cercando e interpretare i

risultati allestito, preparato e osservato al microscopio.

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Infatti, se non c’è sospetto di malattia, è difficile analizzare il campione.

EMOCROMO

= esame multiparametrico = misura tutti i tipi di cellule del sangue (globuli rossi, bianchi e piastrine)

Il sangue è formato da una parte liquida (plasma) e una parte cellulare, che rappresenta circa il 40% totale.

Tutte queste cellule nascono nel midollo oseo —> l’emocromo serve per valutare come funziona il sistema ematologico e individuare eventuali alterazioni.

Globuli rossi

= cellule propriamente dette, senza nucleo

Hanno forma di disco biconcavo, così da facilitare lo scambio di O2.: al microscopio si vedono con zona centrale più chiara e margine periferico più scuro.

Diametro frontale di 7–8 µm.

Piastrine

= non sono cellule intere, ma frammenti di citoplasma dei megacariociti, senza nucleo.

Questi pezzettini di citoplasma si staccano e vengono immessi nei piccoli vasi contenuti nella matrice ossea, p