Lezione 6 Biochimica applicata

CONDIZIONI NON OTTIMALI

Ma cosa succede quando si lavora in condizioni NON ottimali?

1. Importanza del calcolo corretto della velocità

La foto sottostante dimostra cosa succede quando non si calcola la velocità della attività catalitica

nella fase iniziale della reazione, quando essa è massima e costante.

Un calcolo NON corretto di questa può portare all'insorgenza di falsi negativi e falsi positivi.

Il grafico a sinistra rappresenta la produzione del prodotto nel tempo con concentrazioni crescenti di

enzima (1-2-4 unità).

L'unica zona della curva in cui si misura correttamente la velocità (in modo che si abbia una

linearità tra questa velocità e la concentrazione di enzima) è la fase iniziale, al tempo t0.

Il grafico di destra mette in relazione la concentrazione di enzima con la velocità calcolata.

Se la velocità calcolata è corretta, allora si osserva linearità tra enzima e velocità di reazione.

Quindi se velocità è pari a 0,4 microM di prodotto questa corrisponde a 2 unità di enzima.

Se però la velocità viene misurata al tempo t2 (leggermente più avanti) si altera la relazione tra

velocità ed enzima.

Queste differenze si vedono all'aumentare della concentrazione di enzima; se si ha tanto enzima la

linearità viene persa (la linearità viene persa per concentrazioni grandi di enzima).

Ad esempio, a 0,4 microM corrispondono 2,5 unità di enzima (se la velocità è stata calcolata a t1).

Quindi in questo caso si ottiene un falso positivo.

2. Importanza della saturazione dell'enzima

Caso clinico

Un paziente con iperuricemia e gotta (patologia caratterizzata dall'accumulo di acido urico nelle

estremità quali piedi), con HGPRT eritrocitaria (enzima coinvolto nel recupero delle purine)

caratterizzata da una ridotta attività catalitica in vitro.

Cioè il dosaggio di questo enzima HGPRT nel sangue ha dimostrato come questo enzima ha una

ridotta attività catalitica nel sangue.

(HGPRT: Hypoxantine-Guanine-PhosphoRibosylTransferase)

Hypoxantine + PRPP → inosine monophosphate + PPi (PRPP: PhosphoRibosylPyroPhosphate)

Sindrome di Lesch-Nyhan

La sindrome di Lesch-Nyhan è caratterizzata clinicamente da iperuricemia, eccessiva produzione di

acido urico e problemi neurologici come spasticità, ritardo mentale e auto-mutilazioni che di solito

insorgono nella prima infanzia.

E’ associata ad una severa o completa deficienza dell’attività HGPRTasica dovuta all'accumulo di

mutazioni nei geni codificanti per questo enzima.

E' una malattia piuttosto rara.

Essa ha sintomi molto invalidanti soprattutto nella prima infanzia.

Ritornando a parlare del caso clinico...

Il nostro paziente presenta solo la gotta e non le altre manifestazioni della patologia di Lesch-

Nyhan.

Quindi si effettua un dosaggio della proteina ovvero si conduce un Western blot.

Infatti il dosaggio enzimatico ha detto che NON è presente attività catalitica; quindi si effettua un

dosaggio della proteina stessa per vedere se suddetta proteina è presente o no.

Nel caso di pazienti affetti dalla sindrome di Lesch-Nyhan, un saggio di Western blot sui globuli

rossi dimostra che la proteina è assente.

Invece, nel paziente di interesse la proteina è presente (e questo dimostra che non riesco a dosarla

con il dosaggio enzimatico).

Quindi c'è una discrepanza tra sintomi, quantità di proteina e attività catalitica.

Infatti, misuro una attività catalitica più bassa del normale che NON si accorda con i sintomi.

Si sequenzia quindi il gene codificante per la proteina nel paziente; l'analisi genetica in questo

paziente ha rilevato una mutazione che ha causato una riduzione dell'affinità dell'enzima per il

substrato.

Tale mutazione, cioè, ha aumentato la KM.

Quindi, nonostante siano state rispettate le linee guida per il dosaggio dell'enzima, per la presenza di

questa mutazione è stata fornita una quantità di enzima inferiore rispetto a quella necessaria per

ottenere la sua saturazione.

Infatti, la mutazione ha modificato l'enzima per cui si è aumentata la KM quindi la affinità di questo

per il substrato è ridotta.

Utilizzando condizioni non saturanti, si limita la velocità di catalisi della reazione.

Questo dimostra come è importante nella pratica clinica lavorare con cinetiche di ore zero.

Un’accurata determinazione enzimatica è dipendente da cinetiche di ordine zero.

Saggio enzimatico stop/real time

Un saggio enzimatico può essere:

stop time: o single-point o end-point

• real-time: o time-solved

•

Se si sceglie il saggio di tipo stop time, è necessario essere certi di lavorare in condizioni di

linearità in termini di:

concentrazione di substrato

• pH

• temperatura

• cofattori

• forza ionica

•