Laboratorio di biologia

Differenziale

Separa i componenti in base alla loro dimensione e densità. Variando il campo centrifugo applicato e i tempi di centrifugazione, si potranno ottenere dei pellet e dei sovranatanti di interesse.

Centrifugazione in gradiente di densità

Separa le particelle in un gradiente di densità. Quindi si avrà all'interno della provetta da centrifuga un gradiente di densità, quindi un mezzo che ha la sua viscosità generalmente decrescente dall'inizio alla fine. L'omogenato che viene posto sopra a questo mezzo si separerà in funzione del gradiente, cioè le particelle a bassa densità si fermeranno per prime, poi quelle di media densità e infine quelle di densità più elevata, sempre applicando un campo centrifugo.

Centrifugazione differenziale

È quel passaggio che permette di separare differenti componenti cellulari in funzione della velocità di centrifugazione e del tempo applicato. In funzione del tempo e della velocità sarà possibile far precipitare nel

pellet o di far rimanere in soluzione nel sovranatante alcune particelle, se le particelle con le quali poi voglio lavorare finiscono nel pellet io posso andare ad effettuare dei lavaggi del pellet, i precipitati o pellet che si ottengono non sono necessariamente puri.

Dopo la centrifugazione si separa il sovranatante (prelevandolo) e il pellet viene risospeso in tampone e centrifugato allo scopo di:

• Minimizzare la contaminazione di particelle non desiderate
• Migliorare la separazione
• Fornire una frazione quasi pura del pellet desiderato

Si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle che differenziano per densità e dimensioni; durante il processo centrifugativo sedimentano per prime le particelle di maggiori dimensioni.

Se le particelle hanno la stessa massa ma densità diversa, quelle con densità maggiore sedimentaranno più rapidamente di quelle meno dense.

Per effettuare questo tipo di centrifugazione devo conoscere indicativamente

più piccole dovrò utilizzare un’altissima velocità: 150000 volte la gravità (150000xg) per 3 ore ed avere nel pellet ribosomi, virus, etc.

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’

Viene fatta all’interno di una provetta dove io creo un gradiente di densita artificiale, dove ho messo una sostanza sopra la quale io andrò a posizionare il mio omogenato, prima la provetta conteneva solo l’omogenato, non aveva un mezzo nel quale io andavo ad effettuare un gradiente. Mettendolo in centrifugale particelle di mio interesse si separeranno in funzione del gradiente di densita, poi per recuperare la provetta dovrò bucare la provetta, quindi la provetta è un po’ diversa.

Il gradiente di densità del mezzo di sospensione permette di separare le particelle:

• secondo la dimensione (centrifugazione zonale)
• secondo densità (centrifugazione isopicnica)

gradienti più usati: 70- Il cloruro di cesio, utilizzato

centrifugai diversi componenti cellulari si separano in bande distinte, che poi possono essere raccolte separatamente, forando il fondo del tubo e raccogliendo, goccia a goccia, diverse frazioni corrispondenti a diversi strati del tubo stesso.

Attenzione! la durata della centrifugazione è cruciale: deve essere sufficiente per permettere la separazione degli organelli in bande, ma non deve essere troppo lunga per evitare che più bande sedimentino in un unico pellet! Il gradiente di densità ha la funzione di evitare la formazione di moti convettivi che porterebbero ad un rimescolamento del campione.

Si devono usare dei rotori a braccia oscillanti, attraverso questo rotore le provette si trovano in orizzontale e permette di avere una stratificazione parallela alla superficie, quindi gli organuli si sono separati in funzione della massa.

CENTRIFUGAZIONE ISOPICNICA

Separa, in funzione della densità, indipendentemente da forma e dimensioni. Si utilizza un gradiente piuttosto ampio.

A separare le diverse componenti. Un altro metodo per recuperare il compione è quesllo di andare ad aspirare le diverse bande con una pipetta paster.

Non esiste un unico materiale per la preparazione di gradienti di densità che possa essere considerato ottimale per ogni tipo di separazione, poiché la scelta del materiale più adatto dipende dalla natura delle particelle che devono essere separate. I materiali comunque devono avere le seguenti caratteristiche:

• Elevata idrosolubilità, devono permettere di poter effettuare dei gradienti di densità elevati, perché per la separazione zonale o a banda la variazione di gradiente è poca perché va da 5 a 20%, però quello isopicnica la variazione è grande perché arriva da 20 al 70%, quindi si deve scegliere una sostanza che permette di preparare il gradiente a concentrazione elevata
• Elevata purezza e costo moderato
• Limitata o nulla tossicità nei confronti delle

1. Limitata assorbanza nell'ultravioletto e assenza di colore nel visibile per evitare interferenze con i metodi di dosaggio abituali per proteine etc…
2. Elevata solubilità e immunità agli attacchi microbici, per conservare le soluzioni di partenza (stock)
3. Minima viscosità possibile, per ridurre viscosa che si ha quando si lavora con fluidi ad alta densità
4. Pesomolecolare medio-alto per evitare l'effetto osmotico sulle cellule ed organuli

VERIFICA DELLA PUREZZA DELLE FRAZIONI OTTENUTE PER CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA'

Naturalmente, l'assunzione è che la localizzazione subcellulare di questi marker sia rigidamente predeterminata (cioè che la fosfatasi acida sia solo nei lisosomi, che il DNA sia solo nel nucleo etc…); è utile verificare la purezza degli organelli utilizzando più di un marker. In genere, per valutare l'andamento di una purificazione (di un organello, o anche

CENTRIFUGHE E ROTORI

Piccole centrifughe da banco, microcentrifughe

• Massimo volume di carico: 24 microprovette da ml 1,5/2.0
• Massima velocità (RPM): 13000

Centrifughe a grande capacità

• Sono generalmente delle centrifughe da terra e sono in grado di centrifugare delle provette che vanno da 10-100 ml

Centrifughe ad alta velocità

• Sono centrifughe da terra e raggiungono velocità di 40.000 RPM

Ultracentrifughe

• Possono mandare il rotore fino a 150.000 xg e possiamo distinguere le centrifughe Preparative o analitiche
• Tutte possono essere dotate di un sistema di refrigerazione che permette di mantenere il rotore e quindi il campione a basse temperature per evitarne la denaturazione

ROTORI

Il rotore varia dal tipo di provetta che viene collocata all'interno, varia dal fatto che sia ad angolo fisso o