Genetica medica

Corso di genetica medica

La genetica è una scienza che studia le variazioni o caratteri ereditari tra gli individui. I caratteri ereditari sono quelle caratteristiche che abbiamo e che distinguono ognuno di noi dal resto della popolazione umana. Sono caratteri sia quelli che fanno riferimento al nostro aspetto fisico (colore degli occhi, capelli, altezza, peso) sia i caratteri ereditari che hanno un risvolto nella pratica clinica (anemia falciforme, sindrome di Down, nanismo acondroplasico).

Domande fondamentali nello studio delle patologie

Per studiare una patologia è fondamentale porsi delle domande: "Qual è la causa della malattia? Perché i pazienti si ammalano?". A livello del patrimonio genetico c'è qualcosa che causa la manifestazione di quella determinata patologia o fenotipo, questo viene studiato dalla genetica molecolare. La modalità di trasmissione dei caratteri ereditari da una generazione all'altra viene studiata dalla genetica formale (fa riferimento alle leggi di Mendel). Oltre al singolo individuo e alla famiglia possiamo espandere la nostra indagine alla popolazione, questa parte della genetica prende nome di genetica di popolazione.

Le basi genetiche delle malattie

Distinguiamo 3 macro categorie di malattie genetiche:

• Malattie monogeniche o mendeliane: difetto in un singolo gene (porzione di DNA che codifica per un fenotipo). Si manifestano maggiormente nei primi anni di vita. Nelle malattie monogeniche ci aspettiamo un singolo difetto o mutazione e questo difetto è sufficiente per la manifestazione del fenotipo. Esempi: acondroplasia, anemia falciforme.
• Malattie cromosomiche: il riarrangiamento genomico riguarda un tratto o un intero cromosoma. Le malattie cromosomiche hanno un impatto fenotipico molto evidente e si rendono evidenti già alla nascita e talvolta anche prima della nascita rendendo la vita post natale impossibile. Il problema delle anomalie cromosomiche è che c'è uno sbilanciamento della dose dei geni che mappano nei cromosomi coinvolti. Esempi: sindrome di Down.
• Malattie multifattoriali: necessitano per svilupparsi di difetti in tanti geni distinti che possono essere sparpagliati per l'intero genoma. Per la manifestazione di queste malattie abbiamo anche bisogno dell'interazione con fattori che non sono genetici (fattori ambientali: aria, stile di vita, dieta). Alcune malattie si manifestano alla nascita (esempio: labioschisi) e hanno un picco molto elevato in età adulta. Osserviamo tanti difetti, anche decine o centinaia, ciascuno con impatto fenotipico piccolo e insufficiente alla manifestazione fenotipica. Esempi: obesità (ci sono forme in cui la componente genetica è molto forte).

HIV

Si è notato che un certo numero di soggetti acquisivano l'infezione ma la malattia AIDS non si manifestava perché queste persone avevano una variante che proteggeva dalla malattia. Questa variante è una delezione del recettore per le chemochine CCR5 che è il recettore con il quale l'HIV prende contatto con la cellula per infettarla. L'HIV può essere considerata quindi una malattia multifattoriale perché è determinata dal virus HIV però deve essere presente anche il gene per CCR5. NB: gran parte delle malattie umane ha una base genetica, le uniche malattie non genetiche sono quelle da trauma.

Difetti genetici

I difetti genetici sono diversi:

• Mutazioni puntiformi: un solo nucleotide (individuabile col sequenziamento del genoma).
• Microdelezioni o microduplicazioni.
• 5-10 milioni paia di basi: anomalie cromosomiche.

Test diagnostici

In base alla dimensione delle variazioni, si usano tecniche diverse in laboratorio:

• Bandeggio dei cromosomi per riarrangiamenti di un cromosoma oppure suoi segmenti di almeno 5-10 milioni di basi.
• Sequenziamento del DNA che permette di ricavare la sequenza di nucleotidi che varia in una porzione più o meno grande del nostro genoma.
• Metodiche PFGE o FISH per microdelezioni o microduplicazioni.

Se è presente un sospetto diagnostico bisogna effettuare test genetici specifici pre o post natali. Questi test hanno il compito di identificare il difetto genetico responsabile della malattia, hanno però implicazioni tecniche da risolvere, problemi etici e biologici e per questo vengono sempre affiancati da una consulenza genetica che è il processo informativo attraverso cui pazienti o familiari a rischio per una malattia genetica vengono messi a conoscenza delle conseguenze, della probabilità di manifestazione, di trasmissibilità e delle possibilità di prevenzione e cura.

Test genetici

I test genetici servono a:

• Identificare il difetto genetico responsabile della malattia.
• Diagnosi di individui affetti o a rischio.
• Diagnosi pre e post natale.

Stime di prevalenza di malattie genetiche

Nella popolazione adulta, il 10-15% è affetto da malattie genetiche, di queste il 3-10% sono malattie multifattoriali. Attualmente esistono 9971 malattie genetiche che si possono ritrovare nel OMIM (online mendelian inheritance in man), cioè un catalogo creato dal Dr. McKusick nel 1966. La gran parte delle malattie genetiche sono malattie rare (quelle con prevalenza di 1/2000). Ci sono almeno 7mila malattie rare e l'80% a base genetica.

Ricerca in campo genetico

La genetica medica negli ultimi anni si può avvalere dello strumento del sequenziamento dell'intero genoma o della sua parte codificante, ossia gli esoni, a costi relativamente contenuti (tra i 300/800 euro). Ciò ha reso possibile un aumento delle diagnosi. Un articolo scientifico riporta il progetto "10000 genomi" effettuato in Gran Bretagna per il sequenziamento dell'intero genoma per pazienti con tumori, malattie infettive e sospette malattie genetiche. La resa diagnostica è stata del 25%, fino a un picco del 55% per alcune malattie infantili.

La ricerca ha portato a un risparmio di denaro e tempo sia per il sistema sanitario che per il paziente (che di solito arriva a ottenere una diagnosi dopo 75 mesi) e ha diverse implicazioni pratiche come lo sviluppo di terapie geniche che vanno a correggere il difetto (la coroideremia è stata la prima malattia per cui è stata trovata una terapia genica in cui è stato possibile inserire nelle cellule della retina il gene "normale" non mutato che va a correggere il difetto genetico). Altro esempio è quello di un bambino che alla nascita riportava infezioni severe e sintomi neurologici gravi che lo hanno portato a morte dopo 4 mesi. Dopo un'indagine del genoma è stata trovata una mutazione del gene che porta alla SMA (Spinal Muscular Atrophy). In questo modo è stato possibile somministrare subito alla nascita un farmaco al fratellino per evitare la malattia.

Correlazioni genotipo-fenotipo

Genoma umano

Il genoma può essere sia nucleare (20 mila geni codificanti) sia mitocondriale (37 geni). Il genoma nucleare sta nel nucleo, normalmente è una sostanza colorata visibile al microscopio, durante la metafase della mitosi la cromatina si condensa a formare i cromosomi che sono 46 (23 coppie):

• 22 coppie di cromosomi autosomici.
• Una coppia di cromosomi sessuali XY o XX.

Il numero dei cromosomi per ogni genoma è specie-specifico ed avere un numero superiore o inferiore dell’assetto cromosomico tipico della specie può portare a dei difetti. Su ogni cromosoma c'è una sequenza di nucleotidi che va a formare i geni.

Per avere un’immagine dei cromosomi i passaggi principali sono:

• Prelievo di cellule nucleate (del sangue periferico).
• Induzione alla divisione cellulare utilizzando fitoemoagglutinina (sostanza di origine vegetale).
• Arresto della divisione con un veleno, la colchicina (sostanza di origine vegetale) capace di bloccare le fibre.
• Colorazione Giemsa.
• Osservazione e fotografia al microscopio ottico.

Questa colorazione ci permette di vedere i cromosomi colorati ma anche di osservare le bande G, prendono questo nome perché sono state ottenute con la colorazione Giemsa ma se si cambia colorazione possono assumere nomi diversi. L’ordinamento dei cromosomi avviene in base a:

• Dimensione: dal più grande al più piccolo (il più grande è il cromosoma 1 con 2000 geni, i più piccoli sono i cromosomi 21-22 con circa 250 geni).
• Posizione del centromero: esistono cromosomi:
  • Metacentrici: il centromero è perfettamente in centro.
  • Submetacentrici: il centromero è lievemente spostato verso il lato.
  • Acrocentrici: il centromero è molto spostato verso l’estremità.
  • Telocentrici: il centromero è spostato sul telomero. Nell’uomo questi centromeri non esistono.
• Bandeggio: quando ho cromosomi molto simili.

Genoma nucleare

Il genoma nucleare è costituito al 75% da DNA extragenico, principalmente sequenze uniche e meno sequenze ripetute e il 25% da geni. Un gene è costituito da esoni, introni, UTR, promotore. La porzione esonica corrisponde all'1,2% dell’intero genoma.

Flusso dell’informazione genetica

Partiamo dal DNA che sta nel nucleo, il quale viene trascritto in RNA, acido nucleico a singola elica. Deve lasciare il nucleo per andare nel citoplasma, ma prima di farlo avviene lo splicing e altre modifiche come il capping e la poliadenilazione. L’mRNA maturo nel citoplasma incontra l’apparato di traduzione con i ribosomi che lo traduce in proteina. Tutto questo se si tratta di un gene codificante per proteina. I geni dell’rRNA non codificano per proteine insieme ai tRNA. Inoltre vi è una famiglia di non-coding RNA che non codifica per proteine, gli pseudogeni che ormai hanno perso la loro funzione.

Basi molecolari di un carattere ereditario

Una sequenza nucleotidica può presentare variazioni che però non portano a malattie (polimorfismo genetico). Queste variazioni di sequenza sono frequenti nella popolazione (superiore all'1%). Le variazioni di sequenza del DNA vengono definite mutazioni quando la variazione è rara. Le variazioni di sequenza possono interessare le cellule germinali e sono ereditarie, oppure possono essere somatiche che si possono trasmettere da una generazione all'altra perché presenti in tutte le cellule dell'organismo comprese le cellule germinali.

Le variazioni di sequenza possono essere:

• Puntiformi: coinvolgono una sola base. Le mutazioni puntiformi possono riguardare:
  • Sostituzioni: un nucleotide viene sostituito con un altro, quindi il codone che prima codificava per un amminoacido ora può:
    • Codificare per un altro amminoacido (mutazione missenso).
    • Codificare per un codone di stop (mutazione nonsenso o loss of function) per esempio nella beta talassemia in cui AAG (lisina) TAG (stop). Un trascritto che contiene un codone di stop prematuro va incontro a degradazione del trascritto (nonsense mediated decay) in cui il ribosoma fa una prima lettura dell'mRNA e mentre passa toglie delle proteine che sono le EJC (exon junction complex), tuttavia se trova un codone di stop prematuro, le proteine a valle non vengono rimosse e queste fungono da segnale per la cellula di degradare questo trascritto, quindi la proteina non viene proprio prodotta.
    • Codificare per lo stesso amminoacido (mutazioni sinonime) poiché il nostro codice genetico è degenerato cioè abbiamo 64 possibili cordoni ma solo 20 amminoacidi.
  • Delezioni: perdita di un nucleotide (non multiplo di 3), la conseguenza è che c'è uno slittamento della cornice di lettura (frameshift) quindi cambiano potenzialmente tutti gli amminoacidi successivi al punto di delezione (mutazione loss of function).
  • Inserzioni: aggiunta di un nucleotide (non multiplo di 3), anche in questo caso abbiamo uno slittamento della cornice di lettura.
• "Grandi": coinvolgono più di 2 basi o anche un intero gene. Anche in questo caso prendiamo come riferimento l’emoglobina, un tetramero costituito da 2 catene beta il cui cluster mappa sul cromosoma 11 e 2 catene alfa il cui cluster mappa sul cromosoma 16. Le alfa e beta globine derivano da un progenitore comune che è un gene globinico che si è evoluto, si è duplicato per poi traslocare su due cromosomi diversi che fanno parte della famiglia delle globine.
  • Nelle alfa globine spesso le mutazioni che prevalgono sono le grosse delezioni che portano via solo uno dei due geni alfa oppure tutti e due, in questo caso il fenotipo malato sarà molto più grave rispetto al fenotipo di una delezione più piccola che mantiene almeno 1 gene alfa.
  • Nelle beta globine prevalgono le mutazioni puntiformi.

Quando abbiamo una mutazione del gene dell'alfa globina, la talassemia viene identificata come alfa talassemia, mentre la beta-talassemia è causata da mutazioni del gene beta. L’effetto fenotipico è però spesso simile perché, se la proteina alfa o beta non viene espressa provoca una grave forma di anemia che necessita trasfusioni o il trapianto del midollo osseo.

Mowat-Wilson Syndrome

Le grosse mutazioni possono avere spesso degli effetti anche più complessi e variegati come la mutazione che è stata descritta in una bambina di 2 anni che presenta una forma di ritardo del neurosviluppo. Con questo termine facciamo riferimento a diverse caratteristiche, tra cui la parte di disabilità intellettiva: il bambino può camminare in maniera scorretta, interagire scorrettamente con l’adulto, faticare ad afferrare degli oggetti. Tutti questi esempi sono delle tappe temporali che il bambino segue durante il proprio sviluppo e che in questo caso vengono a mancare.

A questo punto l’esperto è in grado di riconoscere la mancanza di queste importanti tappe di sviluppo. Inoltre, questa bambina ha qualche caratteristica nel volto differente come la forma e la distanza degli occhi, la forma del naso e ulteriori problemi di crisi come convulsioni più o meno gravi. Nell’insieme, tutte queste caratteristiche elencate che sono difficili da riconoscere, conducono alla sindrome di Mowat-Wilson. La sindrome è causata dal gene ZEB2, codificante per una proteina con un homeodomain importante per lo sviluppo (molecola interessata nella deacetilazione, fase del rimodellamento istonico). Spesso le mutazioni che riguardano questo gene sono puntiformi e di conseguenza si riflettono sulla funzione della proteina.

Nella bambina descritta in precedenza non sono presenti mutazioni puntiformi su questo gene, infatti, all’inizio si pensava che non avesse a che fare con questa malattia anche se gli esperti dopo averla visitata avevano sospettato che fosse affetta da questa sindrome. Alla fine, i genetisti hanno voluto mappare meglio la regione dove è presente ZEB2, non trovando mutazioni puntiformi ma una delezione della regione dove è presente ZEB2 e parte del gene attiguo GTDC1. Andando ad analizzare questa regione dove è avvenuta la delezione si nota che viene a formarsi una proteina chimerica cioè costituita da un pezzo di un gene e da un pezzo di un altro. In realtà, questa fusione porta a un codone di STOP prematuro con conseguente degradazione del trascritto.

CNV (copy number variants)

Se andiamo a misurare il genoma questo non è costituito da 3 miliardi di nucleotidi in ognuno di noi, tra un individuo e l'altro ci possono essere differenze fino a 20 milioni di basi. Questo perché esistono nel nostro genoma almeno 300 posizioni per le quali ciascuno di noi ha un dosaggio diverso da un altro (ci possono essere copie diverse di quelle parti di genoma). Queste regioni si trovano in tutti i cromosomi e si possono trovare anche duplicate o triplicate (duplicazioni) oppure delle porzioni dove una porzione genomica può essere o meno (delezione). A queste sequenze viene dato il normale di copy number variants.

Per esempio ci sono da 2 a 15 copie di AMY (salivary alpha-amylase) che porta alla produzione di una proteina contenuta nella saliva che serve per la fase iniziale della digestione. Più geni AMY abbiamo più mRNA AMY abbiamo e quindi più proteina viene prodotta (ci aspettiamo che chi ha più copie e quindi più proteina prodotta digerisce meglio l'amido).

Come originano le copy number variants

Le copy number variants ricorrono solo in certe porzioni del genoma dove sono fiancheggiate da due sequenze ripetute tra di loro simili. Durante la mitosi quando si verifica l'appaiamento dei cromosomi omologhi c'è un appaiamento sfasato perché le sequenze sono molto simili. Caso vuole che si verifichi anche un crossing over per cui su un cromosoma ci sono più copie del gene mentre sull'altro cromosoma nessuna.

Gene AMY

Un altro esempio che si rifà all’ambito evolutivo è quello di un gene presente nella popolazione non legato a una patologia ma esemplificativo della variabilità polimorfica genetica interindividuale, che codifica per l'alfa-amilasi salivare, un componente della saliva avente il ruolo di iniziare la digestione dell’amido. Il gene AMY lo possiamo immaginare come copia, ognuna per entrambi i cromosomi omologhi, ma in realtà non è così. L’intero gene AMY è il costituente di una copy number variant perché ci sono soggetti che presentano 2 geni AMY, uno ereditato dal papà e l’altro dalla mamma, mentre altri che ne possiedono fino a 15.

Come si può osservare dall’istogramma i due estremi sono rappresentati da 2 e 15, mentre la media di geni AMY è tra 5 e 6. Questa variabilità non comporta una patologia, ma evolutivamente ha avuto un certo ruolo come osservato.