Genetica forense - l'era della genomica

DNA RIPETUTO IN TANDEM

All'interno del nostro genoma si identificano sequenze di DNA ripetute in tandem, ovvero regioni

del genoma in cui una certa sequenza viene ripetuta più volte in maniera successiva (blocchi di

sequenze ripetute un certo numero di volte).

Esistono differenti tipologie di DNA ripetuto in tandem; si distinguono, infatti, in base alla

dimensione del blocchetto che viene ripetuto:

DNA satellite: il DNA satellite può raggiungere lunghezze comprese tra 100mila e diverse

• Mb.

La dimensione del blocchetto ripetuto è di circa 170-25 bp.

Tale DNA si identifica specialmente a livello dei centromeri.

E' un DNA che non viene trascritto (inattivo dal punto di vista trascrizionale).

Possono esserci diversi tipi di DNA satellite (alfa, beta, ecc)

DNA minisatellite: il DNA minisatellite può raggiungere lunghezze comprese tra 0,1-20 kb.

• La dimensione del blocchetto ripetuto è più piccolo rispetto a quella del DNA satellite.

Tale DNA si identifica specialmente in prossimità dei telomeri di tutti i cromosomi.

La maggior parte del DNA minisatellite non viene trascritto

DNA microsatellite: il DNA microsatellite può raggiungere lunghezze inferiori a 100 bp.

• E' costituito da ripetizioni di una sequenza molto semplice; infatti, il DNA microsatellite è

costituito da blocchetti ripetuti molto piccoli; tali blocchetti hanno dimensioni variabili da 1

a 4 bp.

Nella maggior parte dei casi, si ha una ripetizione di 2 bp (CA).

Esso lo si identifica disperso all'interno di tutti i cromosomi.

DNA SATELLITE

Il DNA satellite è organizzato in schieramenti molto lunghi (da 100mila bp a qualche Mb) di DNA

ripetuto in tandem, che costituisce la maggior parte delle regioni eterocromatiche (eterocromatina

costitutiva; essa non contiene geni di solito) del genoma, in particolare in vicinanza dei centromeri.

Il DNA centromerico dei cromosomi umani è costituito da varie famiglie di DNA satellite.

Si distinguono, infatti, 5 famiglie di DNA satellite:

alfa: è la famiglia con blocchi ripetuti più grandi

• beta

• satellite 1

• satellite 2 e 3

•

Di tutte queste famiglie, solo l’alfa è presente in tutti i cromosomi ovvero forma il centromero di

tutti i cromosomi.

E’ stato dimostrato che alfa-satellite clonato in cellule che ne sono prive, esso è in grado di produrre

centromeri de novo in cellule umane, suggerendo un suo ruolo importante nella funzione

centromerica.

(i centromeri sono importanti nella divisione mitotica perché qui si attaccano le fibre del fuso

mitotico)

Ricorda!

Il centromero a livello dei cromosomi può avere una diversa localizzazione; si può avere un

centromero non in mezzo (quindi si riconosce un braccio corto e uno lungo) oppure un centromero

in posizione centrale.

DNA MINISATELLITE

Il DNA minisatellite è organizzato in più di 1000 schieramenti di corte unità (da 6 a 64nt; sono più

corte di quelle del DNA satellite) ripetute in tandem, localizzate prevalentemente nelle regioni

subtelomeriche (nelle regioni che si trovano in prossimità dei telomeri di tutti i cromosomi).

Alcune sequenze del DNA minisatellite formano i telomeri veri e propri; altre sono localizzate in

prossimità dei telomeri.

Essendo che la dimensione delle unità ripetute è variabile (da 6 a 64 bp), l'estensione totale del

DNA minisatellite è compresa tra 100 bp e 20mila bp.

Le unità ripetute posseggono, come già detto, dimensioni variabili (si parla di minisatellite

ipervariabile) ma una comune sequenza centrale (core).

Il DNA minisatellite costituisce un punto caldo di ricombinazione omologa.

Una delle principali applicazioni del DNA minisatellite è il fingerprinting del DNA, in cui

un’unica sonda di DNA, che contiene la sequenza centrale comune (core), può ibridare

simultaneamente con più loci di DNA satellite su tutti i cromosomi, determinando un complesso

schema di ibridazione specifico per ciascun individuo.

Ogni individuo, infatti, ha una caratteristica del DNA minisatellite.

(la sonda riconosce la sequenza core)

Il fingerprinting del DNA è stato utilizzato nella genetica forense per riconoscere il profilo di DNA

di un individuo.

La composizione del DNA minisatellite (numero di ripetizioni) è variabile da individuo a individuo.

Le regioni fiancheggianti il DNA minisatellite hanno una sequenza unica.

Una delle principali famiglie di sequenze di DNA minisatellite è il DNA telomerico.

Il costituente principale del DNA telomerico è dato da 3-20 kb di unità esanucleotidiche (6 nt)

ripetute in tandem (TTAGGG), che vengono aggiunte da un enzima specializzato, la telomerasi.

Queste ripetizioni agiscono come protezioni delle estremità dei cromosomi dalla degradazione e

dalle perdite di materiale e forniscono un meccanismo per la replicazione delle estremità lineari del

DNA cromosomico.

In che modo accade ciò?

Durante la replicazione del DNA, a livello del filamento lagging (ritardato) si ha un processo di

sintesi discontinua (infatti il filamento ritardato si forma per unione dei diversi frammenti di

Okazaki). Nel momento in cui viene rimosso il primer presente all'estremità 5' del filamento

lagging, rimane un segmento di DNA non replicato che non può essere riempito dalle polimerasi

conosciute. Interviene invece la telomerasi: tale enzima non estende il filamento al 5' più corto ma

allunga ulteriormente il terminale 3' sporgente. Per fare questo, il terminale 3' sporgente si appaia

con la telomerasi (che ha una sequenza ad esso complementare) che poi copia la sequenza del suo

RNA (si ricordi che la telomerasi è formata da una porzione proteica che agisce come trascrittasi

inversa e da un RNA stampo). In questo modo si allunga la sequenza 3' sporgente.

La successiva traslocazione e riposizionamento della telomerasi fanno i che questo processo si

ripeta più volte, determinando l'aggiunta di numerose unità della sequenza telomerica ripetuta.

Infine, per ricostituire il telomero, interviene la DNA polimerasi alfa-primasi che copia il filamento

in 3' esteso dalla telomerasi.

Cioè, l’ulteriore prolungamento del filamento guida fornisce lo stampo necessario per completare la

sintesi del filamento in ritardo ad opera della DNA polimerasi alfa-primasi.

DNA MICROSATELLITE

Il DNA microsatellite è detto anche short tandem repeats (STR).

I microsatelliti sono piccoli schieramenti di ripetizioni in tandem (10-20 moduli/ripetizioni) a

lunghezza variabile di sequenze molto semplici (da 1 a 4 nt; sono più piccoli questi blocchetti

rispetto a quelli del DNA satellite e minisatellite).

L'estensione totale dei microsatelliti è inferiore a 100 bp.

Sono delle sequenze molto polimorfe (variabili tra individui diversi).

(Da genomica: i microsatelliti sono sequenze ripetute di DNA non codificante costituiti da unità di

ripetizione molto corte disposte secondo una ripetizione in tandem).

I microsatelliti sono localizzati lungo tutto il genoma ovvero sono dispersi lungo tutti i cromosomi;

in media essi si trovano ogni 10mila bp nel genoma di un organismo eucariote.

La funzione del DNA microsatellite è sconosciuta.

A seconda della lunghezza dell'unità che viene ripetuta in tandem, si distinguono microsatelliti:

mononucleotidici: sono comuni le ripetizioni di T e A

• dinucleotidici: sono molto comuni le ripetizioni CA/TG e CT/GA

• tri e tetra nucleotidici: sono le più rare, ma egualmente polimorfe (il numero di questi

• blocchetti ripetuti in individui diversi della popolazione è molto variabile)

Come si evince dall'immagine sottostante, i microsatelliti sono delimitati da regioni di limite,

ovvero sequenze uniche.

Continuiamo a parlare dei microsatelliti.

I microsatelliti vengono definiti anche short sequence repeats (SST).

Essi costituiscono una classse di DNA ripetitivo ampiamente presente nel genoma.

Si ricordi che gli alleli di un certo locus microsatellite, all'interno di un individuo, possono essere

diversi tra di loro.

Cioè il DNA microsatellite è estremamente polimorfo ovvero differente tra individui diversi; cioè

se analizzo la stessa sequenza microsatellite in un individuo e in altri individui, osservo che il

numero di ripetizioni è differente sia a livello dei due alleli (nelle due copie del cromosoma) del

medesimo individuo sia a livello di individui diversi.

Il fatto di trovare in uno stesso individuo, a livello dei due cromosomi, un numero di ripetizioni

differenti, permette di distinguere i due alleli di un individuo (si hanno alleli diversi).

Quindi analizzando loci diversi che contengono suddette sequenze ripetute, essendo molto variabile

il numero di sequenze ripetute, è molto probabile che nei due cromosomi omologhi trovo un

numero di ripetizioni diverso.

Ad esempio, uno può avere 4 ripetizioni e l'altro 5 ripetizioni della stessa unità (es AC).

Inoltre è probabile che si abbia una diversità nel numero di ripetizioni anche tra soggetti diversi.

Origine dei microsatelliti

I polimorfismi dei microsatelliti dipendono dallo slittamento del filamento nel corso della

replicazione del DNA.

La DNA polimerasi può andare incontro, infatti, a una sorta di “balbuzie” (slippage) durante la

replicazione, ossia può scivolare indietro e replicare una seconda copia dello stesso dinucleotide,

oppure saltare oltre un dinucleotide.

Se la struttura a loop (forcina), durante il meccanismo replicativo si forma nel nuovo filamento,

allora le stesse unità ripetute già copiate vengano nuovamente copiate. Quindi si ottiene un

microsatellite con più ripetizioni rispetto al filamento stampo. Invece, quando il loop si forma nel

filamento stampo, allora tali ripetizioni non sono copiate dalla DNA polimerasi e si forma un

microsatellite con minor ripetizioni rispetto al filamento stampo.

Quindi nel corso della replicazione del DNA possono insorgere degli errori dovuti allo slittamento

della polimerasi nel filamento stampo o nel filamento di neosintesi; questo mantiene il

polimorfismo di queste sequenze genetiche.

I microsatelliti sono perciò altamente polimorfici nel numero delle ripetizioni che contengono, con

molti alleli distinguibili a ogni locus microsatellite.

COPY NUMBER VARIATIONS (CNV)

Le CNV sono un'altra fonte di variabilità del genoma.

Le copy number variations sono ripetizioni in tandem di sequenze di grandi dimensioni >1kb

(fino a 3Mb).

Le CNV hanno cioè maggiori dimensioni rispetto al DNA satellite, minisatellite e microsatellite.

Esse sono spesso osservate a frequenze polimorfiche nelle popolazioni.

Cioé, queste CNV possono trovarsi all'interno della popolazione in un numero variabile di