Genetica dei microrganismi

A

ORI-C : è l’origine della replicazione, costituita di sequenze ripetute (circa 250bp)

3 sequenze da 13 nucleotidi, ricche di A-T (sequenze tredicimere)

Dna A-box

4 siti di legame per la proteina DNA da 9bp ( )

A

La replicazione ha inizio con l’attacco delle DnaA (proteina iniziatore) all’origine

 oriC

Tramite un legame cooperativo, le DNA si legano tra loro formando un

 A

aggregato, attorno al quale si avvolge il DNA

I filamenti di DNA si separano a livello delle sequenze da 13 nucleotidi, grazie

 alle elicasi

Si formano le forche di replicazione

 Le proteine SSB stabilizzano i filamenti aperti

 La primasi deposita il primer per la polimerasi 3, che inizia la sintesi

 La polimerasi 1 sostituisce il primer di RNA con del DNA (digestione + sintesi)

 La ligasi riunisce i frammenti di DNA sintetizzato dalla pol.1



DNA POL 3: olo-enzima (10 subunità); 10-20 molecole nella cellula

Core (3 subunità→ α, ε, θ)

 Proteina τ

 (dimerizza il core) : formazione pol.*

Subunità α (130 kd), attvità polimerasica 5’-3’

Subunità ε (25 kd) attvità esonucleasica 3’-5’

(correzione bozze)

9(

Subunità θ (10 kDa) necessaria per legame con τ

Complesso ϒ (caricatore della pinza)



Subunità che si lega al dimero formando la pol.’, questo complesso serve per

l’aggancio della pinza

Subunità β

 (pinza)

Serve a legarsi al DNA, formata da 2 subunità

PROCESSIVITÀ : capacità di restare agganciato durante la sintesi, il core la ha di

10nucleotidi, la pol* di 60, la pol’ di 200 (in presenza di SSB), la pol3 più di 10.000

Quando la pinza carica il DNA, il complesso gamma

idrolizza ATP, c’è solo un complesso gamma per caricare

la pinza sul filamento lento (copia). La Pol III si stacca dal

filamento quando incontra un’incisione nel filamento

(avviene durante la sintesi dei frammenti di Okazaki) e si

attacca in un altro punto con un’altra pinza β

Il DNA forma un giro su se stesso, così la sintesi

prosegue nella stessa direzione, nonostante il

filamento ritardato vada da 3’-5’

TER-C : arresto della forca di replicazione, serie di regioni da 23bp, che fanno parte del

TER. Vengono riconosciute dalla proteina TUS, codificata dal gene tus. Le sequenze

TER funzionano solo in un senso (C e B per la forca 2; E, D, A per la forca 1), si evita la

perdita di informazioni poiché le forche si incontrano prima di terminare.

REPLICAZIONE DNA EUCARIOTI: la ridondanza di DNA (per le funzioni

fondamentali) sembra aver favorito la fase evolutiva, rendendo il sistema genetico più

stabile

Procarioti : circa 1000-1200bp per gene

Eucarioti 7 11

: a 10 a più di 10 , senza relazione con la complessità dell’organismo

geni codificanti per proteine in copia singola

 geni codificanti per proteine organizzate in famiglie geniche

 geni per rRNA, tRNA ed istoni organizzati in unità ripetute in tandem

 geni per ncRNA



9(

Il cromosoma eucariotico è lineare, e i cromosomi hanno più repliconi (punti di origine

della replicazione). Ogni replicone è bidirezionale.

REPLICONE : regione replicata da un’origine, ogni punto si attiva solo 1 volta durante

la replicazione. Tutti i repliconi di un cromosoma devono essere attivati nel corso di un

ciclo cellulare, ma non simultaneamente

Replicatore : l’intero set di sequenze di DNA in grado di dirigere l’inizio della

 replicazione. (lunghezza maggiore di 1000 bp)

Iniziatore : proteina che riconosce il replicatore e attiva l’inizio della

 replicazione, reclutando le proteine necessarie

FASE S

La replicazione coincide con la : sintesi del DNA, usate le polimerasi α, δ, ε

1. Complesso ORC (iniziatore), si lega alla regione ARS (ORI-C)

2. Proteine MCM (elicasi)

3. Polimerasi α (primasi)

Ogni regione deve attivarsi solo una volta, man mano che si attivano, le forche di

replicazione si uniscono se sono vicine. Non è detto che ogni regione si attivi per conto

suo, l’ importante è che tutte le regioni siano replicate.

PRE-RC : si forma in fase G1( dopo la mitosi, c’è un periodo di riposo di durante il

quale non si attua la sintesi di DNA), pre replicazione, si attiva solo in fase S, è un

complesso richiamato da ORC.

L’iniziatore ORC si lega al replicatore, richiamando proteine per formare il pre-

 RC, la fosforilazione di queste proteine avvia la replicazione.

La cromatina va dis-assemblata e poi ricostruita nelle cellule figlie

 E’ probabile che i nucleosomi vengano disassemblati a monte della forca

 replicativa e riassemblati sui filamenti figli

ISTONE H1 : sgancia il DNA dal nucleosoma (solo in eucarioti superiori), si forma una

struttura a zig zag della cromatina, che aumenta l’impacchettamento del DNA

RIMODELLAMENTO CROMATINA : due classi di complessi enzimatici

Acetilasi e deacetilasi : modificano la carica delle braccia degli istoni

 introducendo o rimuovendo gruppi acetile sui residui di lisina. L’aumento

dell’acetilazione implica l’apertura della doppia elica per la trascrizione del gene

complessi enzimatici idrolizzando l’ATP modificando la cromatina



TELOMERI : terminazione del cromosoma, formato dalla ripetizione di poche basi. Non

contiene sequenze di sintesi (non codificanti). Impedisce che l’ultimo primer, che non

può essere sostituito dalla pol1, venga rimosso causando un accorciamento ad ogni

replicazione. TTAGGG (nell’uomo)

TELOMERASI : enzima (polimerasi RNA dipendente), che ha una parte proteica e una

di RNA (ricca in C e A), che corrisponde alla sequenza di un telomero. Si appaiano

senza necessità di aggancio, solo grazie al pezzo di filamento singolo non replicato

(telomero). 3 nucleotidi alla fine del telomero, sono complementari all’RNA della

telomerasi creando il complesso stampo-innesco, inizia così un processo di sintesi che

allunga il filamento e trasloca su di esso, fin quando la telomerasi si stacca e il nuovo

9(

pezzo non si ripiega su se stesso, che farà da innesco per la polimerasi. Completato il

filamento fino a colmare il vuoto, una ligasi riunisce il tutto.

Le telomerasi sono attive nelle cellule riproduttive per evitare che la progenie

 erediti cromosomi già invecchiati

le sequenze telomeriche si accorciano fino a raggiungere una lunghezza critica,

 oltre la quale, la mitosi si arresta e le cellule entrano in una fase conosciuta

come stato di “senescenza”

Le telomerasi rappresentano un bersaglio per la terapia antitumorale.



SISTEMI MODIFICAZIONE E RESTRIZIONE : il DNA interagisce con enzimi

RIPARAZIONE : riconosce il danno, sintetizza sequenze ed elimina il danno

RECUPERO : in seguito a danni, recupera sequenze (ricombinazione genetica)

(R)ESONUCLEASI : vanno da 5’-3’ o da 3’-5’, liberano singoli nucleotidi

(R)ENDONUCLEASI : colpiscono determinate sequenze di DNA, tagliano solo all’

interno della catena. Si legano ad una sequenza specifica di DNA (sito di

riconoscimento) e tagliano entrambi i filamenti di DNA.

(M)METILAZIONE : nei batteri è legato alla restrizione, le endonucleasi rimuovono il

DNA estraneo marcato dalla metilazione

E. coli contiene 6-metiladenina e 5-metilcitosina prodotte da tre metilasi:

SISTEMA HSD metilazione adenine (per identificazione dell’ospite) e a volte

 citosine

SISTEMA DAM metilazione adenine del filamento DNA appena formato o del

 filamento da riparare

SISTEMA DCM metilazione citosina, funzione sconosciuta



ENZIMI RESTRIZIONE :

TIPO 2

: 1 enzima che modifica e 1 di restrizione



Riconoscono una vasta gamma di sequenze bersaglio, il sito bersaglio sono sequenze

palindromiche di 4-6 bp

Eco RI : 2 subunità per restrizione (dimero) + 1 subunità per metilazione (monomero),

modifica citosina in pos. 5 e 4, adenina in pos. 6

Metilasi : agisce su DNA non metilato e emimetilato, competizione con restrizione per

sito non metilato

Ogni cellula ha la sua endonucleasi che marca il suo DNA

filamento metilato : non subisce metilazione, non subisce restrizione

filamento emimetilato : subisce metilazione, non subisce restrizione

Il DNA non metilato è estraneo, subisce restrizione e viene frammentato e degradato

dalle esonucleasi

Eco RI : taglia tra G e A, in modo sfalsato

(sticky ends)

Pst I : sempre sticky ends ma sequenza

diversa

9(

Sma I : taglia la doppia elica di netto (estremità piatte)

TIPO 1

: unico enzima con entrambe le funzioni



Eco K

: (R2M2S), sono mutualmente esclusivi

R restrizione

M metilazione

S riconoscimento sito bersaglio

Se ho mutazioni nei geni che producono questi enzimi, il DNA estraneo ha più

 possibilità di integrarsi

Il sito di riconoscimento è bipartito in 2 pezzi

 3bpNNNN4bp

L’enzima va attivato da un cofattore SAM

 che cede gruppi metilici e consente il legame al DNA (modificando la subunità

S)

Se metilato, SAM si lega con uso di ATP e si stacca

 Se emimetilato, SAM si lega e cede un gruppo metile

 Se non metilato, SAM si lega, si stacca e la subunità R taglia dove manca la

 metilazione

TIPO 3

: codificati da un plasmide: EcoP1, EcoP15 e Hinf



L’enzima è fatto da 2 subunità: MS

1. Metilazione (adenina) e riconoscimento ad opera della stessa subunità ( )

2. Restrizione a 24-26bp (poiché MS è grande 75kd ed R 108kd) su un lato con

R

tagli sfalsati ( )

Isolati circa 1.200 enzimi dai procarioti; Riconosciute circa 130 sequenze nucleotidiche

palindromiche

Usati di solito a 37°C; 1 unità di enzima degrada 1 μg di DNA in 1 ora

MAPPA GENETICA : fornisce la localizzazione dei geni in relazione alla posizione di

altri geni noti (si basano sulla ricombinazione)

MAPPA di RESTRIZIONE : identifica una serie lineare di siti bersaglio nel DNA

1. DNA di 5000bp, diviso in 2 da enzima A e B, ottengo frammenti diversi e li

carico in un gel per elettroforesi

2. A: 2100bp, 1400, 1000, 500

3. B: 2500bp, 1300, 1200

4. Ogni frammento di A viene fatto digerire da B (ottengo 1900 e 200), e viceversa

(ottengo 1900 e 600)

5. Il frammento da 1900bp è dato dalla digestione di entrambi gli enzimi, ha un

estremo con A e uno con B

6. Rimettendo in ordine i frammenti, confronto se la somma delle lunghezze mi da

le paia di basi del DNA originale

TRASCRIZIONE DNA : parte dal DNA per ottenere RNA, solo il filamento stampo viene

trascritto

9(

RNA : singola elica, ribosio (con gruppo -OH in pi&ug