Fisiologia Cellulare

POTENZIALE D’AZIONE

Nell’immagine osserviamo:

 Figura in alto: variazione della corrente di membrana (Im) in funzione

del tempo.

0 prima dello stimolo mentre raggiunge il valore Im nel momento in

cui applichiamo lo stimolo se spegnamo va giù istantaneamente. Si

osserva la corrente che attraversa la membrana in 15ms di stimolo;

 Figura sotto: scorporiamo in Ic e Ir.

Ic ->applico corrente e subito va su poi pian piano decade nel tempo;

Ir-> applico corrente e si carica piano piano e andrà giù

successivamente rimanendo costante.

Quindi appena si applica corrente ad una membrana si carica istantaneamente il condensatore,

questo si scarica pian piano nel tempo mentre la corrente resistiva è più lenta ma più stabile nel

tempo.

Quindi se in una membrana biologica ci fosse solamente la membrana ma non i canali saremmo in

grado di registrare delle variazioni di corrente istantanee ma che decadono rapidamente nel

tempo. Se ci fossero solamente resistenze registreremmo una variazione di corrente attraverso

quel canale che aumenta pian piano nel tempo e poi rimane stabile.

Applichiamo uno stimolo (linea rossa) e registriamo una

variazione di potenziale a livello della membrana (liea blu). Il

contribuito della corrente resistiva alla variazione di potenziale -

> aumenta piano nel tempo e poi si stabilizza e rimane così fino a

che non cessa lo stimolo. Quando cessa lo stimolo qualcosa si

muove comunque attraverso la membrana e quindi si vede “la

coda” che rappresenta il caricatore che deve scaricarsi (sarà

l’ultimo) e portare il potenziale di membrana a potenziale di

riposo. V=I*R V=Q*C

Se non ci fosse il condensatore, V salirebbe velocemente.

Se non ci fosse R, V si manterrebbe.

Per avereV si devono attivare dei canali voltaggio-dipendenti.V si associa solitamente al

potenziale d’azione, ma non è sempre così perché dipende dai protagonisti e dall’entità

diV. Il potenziale d’azione ha valori più negativi rispetto a quelli del potenziale di riposo.

VARIAZIONI SPERIMENTALI DEL POTENZIALE DI MEMBRANA

2 cellule, ognuna con 2 elettrodi: uno che fa passare

corrente all’interno della cellula e un altro che misura la

variazione di potenziale nella cellula.

CELLULA DI SX = Se inietto cariche negative nella cellula,

rendo più negativo il potenziale di riposo di quella

cellula e quindi iperpolarizzo la membrana (rendo più

negativo il lato interno della membrana). Cariche

positive si muoveranno dell’esterno verso l’interno

(vengono attratte) e misurerò una corrente entrante.

CELLULA DI DX = Se aggiungono cariche positive rendo meno negativo il potenziale di riposo di

quella cellula e quindi depolimerizzo la membrana (rendo meno negativo il lato interno della

membrana). Cariche positive si muoveranno dall’interno verso l’esterno e quindi misurerò una

corrente uscente.

La corrente è entrante o uscente in base alla direzione della cariche positive

A riposo siamo a zero poi applico un gradino di

corrente negativo (da 0 a -2). Quindi probabilmente

sto iperpolarizzando. Il secondo gradino è più lungo

iperpolarizzo di più. Gradini successivi vanno da 0 a 2 e

quindi depolarizzo, ovvero aggiungo cariche positive.

Cosa succede al potenziale quando aggiungo cariche

positive o negative all’interno della cellula.

In X-> tempo, In Y-> variazioni del potenziale di

membrana che vanno da -100mV a +40mV.

Nella cellula il potenziale di riposo è -65mV-> linea

tratteggiata mentre il potenziale soglia è -50mV.

Valori più positivi del potenziale di membrana -> la

cellula li raggiungerà quando stiamo depolarizzando.

L’inserimento dell’elettrodo genera di per sé una

variazione del potenziale di membrana anche se non

applico corrente.

Primo gradino di corrente negativo -> misuro una variazione negativa del potenziale di membrana

(il potenziale di membrana passa da -65 a -75mV).

Secondo gradino-> iperpolarizazzione maggiore (si arriva a -90).

Quando depolarizziamo registriamo variazioni positive del potenziale di membrana ovvero

diventa meno negativo rispetto al suo potenziale di riposo (passa da -65 a -50mV).

Fino a che l’intensità di corrente che applichiamo al sistema non è in grado di indurre variazioni di

potenziale tali da superare la linea rossa che è la soglia, quella cellula non risponderà con un

potenziale di azione. Quindi fino a quel momento registreremo solo delle variazioni di potenziale

di membrana (negativo o positivo) senza produrre un potenziale di azione. Queste fluttuazioni del

potenziale di membrana sono dovuti a movimenti di ioni attraverso canali ionici. Quando lo

stimolo è tale da superare il valore soglia, si attivano i canali ionici voltaggio-dipendenti ovvero

quelli che rispondono a variazioni sostanziali del potenziale di membrana. Il movimento

attraverso quei canali è rapido tale da produrre un potenziale di azione.

I =I + g (V –E ) Corrente totale

m c x m x

I = corrente di membrana

m

I = corrente capacitiva

c

I = corrente portata da una specie ionica

x

g = conduttanza (n° di canali aperti per ione x)

x

V = potenziale di membrana

m

E = potenziale d’equilibrio dello ione x

x

(V - E ) = forza elettromotrice (f.e.m.) che agisce sullo ione x (tanto maggiore quanto più ci

m x

si allontana dal potenziale di equilibrio)

Stimolo depolarizzante -> Depolarizzazione della membrana -> Più canali per il sodio aperti e

quindi aumenta la permeabilità al sodio -> Il sodio entra nella cellula e porta cariche positive, per

cui si depolarizza la membrana e riparte questo ciclo. Questo perché il sodio che entra non fa

altro che amplificare la depolarizzazione portata dallo stimolo. Meccanismo a feedback positivo.

Per studiare quali sono le correnti portate da uno stimolo iperpolarizzante o depolarizzante si

deve bloccare uno di questi step.

Per studiare le singole correnti ioniche e responsabili del potenziale di membrana, si usa la

tecnica VOLTAGE-CLAMP (blocco del voltaggio). È

una tecnica elettrofisiologica che ha permesso di

capire quali sono le correnti responsabili del

potenziale d'azione. Quindi blocco il potenziale di

membrana al valore desiderato sperimentale e

conosco quali sono le correnti ioniche associate a

quel valore del potenziale di membrana che ho

deciso sperimentalmente.

Quindi ho una piastra petri all’interno della quale

ho una soluzione fisiologica, all’interno della quale

è immerso un assone gigante di calamaro.

All’interno dell’assone inseriamo l’elettrodo di

registrazione che inietta corrente. Abbiamo un

altro elettrodo ovvero elettrodo di riferimento

immerso nella soluzione salina. Entrambi gli elettrodi

arrivano ad un misuratore del voltaggio. Questo è

collegato ad un amplificazione differenziale. Al meno

arriva il valore de l potenziale di membrana registrato

lungo l’assone rispetto all’elettrodo di riferimento (è lo

0 sperimentale). Quindi il sistema fa la differenza tra

quello che misuro nella cellula rispetto all’elettrodo

immerso nel liquido.

Nell’amplificatore differenziale c’è un comando di

voltaggio che permette di definire quale è il voltaggio

sperimentale.

Quindi inietta tanta corrente nel sistema tale da raggiungere il potenziale di membrana

sperimentale.

Bloccando il voltaggio (blocco il ciclo) ad un valore fisso obbligo la cellula a rimanere a quel

voltaggio e quindi posso studiare tutte le correnti ioniche che determinano quella variazione di

voltaggio che rimane stabile.

Il comando Vc in questo caso è pari a 0, quindi il sistema ha registrato all’interno della cellula un

valore di potenziale di membrana = -65mV tenendo come riferimento l’elettrodo esterno. Noi

impostiamo la Vc =0 quindi imponiamo al nostro sistema di passare da -65 a 0. Quindi il

potenziale di membrana nella cellula cambierà di +65 mV. Arrivati a 0 il valore del potenziale di

membrana rimarrà 0 per tutto il tempo della registrazione. In questo modo posso calcolare tutte

le correnti ioniche che permettono al potenziale di passare da -65 a 0mV. Ovvero permette di

studiare quei meccanismi (la corrente ionica) che determina la depolarizzazione di questa cellula.

Attraverso gli elettrodi di riferimento vado a registrare le

correnti ioniche che attraversano la membrana a quel valore

di potenziale. Le correnti che vanno verso il basso sono

correnti entranti, mentre quelle che vanno verso l’alto sono

uscenti. Quando avviene la variazione del potenziale di

membrana registro un picco di corrente che è la corrente che

passa attraverso la capacità della membrana cellulare. Si

carica il condensatore e poi misuro una corrente transiente

entrante e una corrente ritardante uscente.

Il grafico con la linea nera rappresenta l’andamento di tutte

le correnti ioniche (Na + K) responsabili della variazione di

potenziale rappresentata dal grafico sovrastante.

Sperimentalmente per capire quale è il contributo di ciascuna specie

ionica a quella corrente si usano dei bloccanti (TTX = tossina che

blocca) per andare a bloccare i canali ionici voltaggio-dipendenti per

il sodio e il potassio per andare a registrare il contributo di quello

ione nel determinare questa corrente. Bloccando la corrente del

sodio, individuo la corrente del potassio (flusso degli ione del K

attraverso i canali ionici selettivi per il K) che sale lentamente, è

stabile nel tempo ed è una corrente uscente. Blocco la corrente del

potassio con TEA e misuro solo la corrente portata dal sodio che è

entrante rapida e poi nell’arco di pochi millisecondi torna a 0.

Se per tutto il tempo della registrazione sono in grado di mantenere

stabile la corrente portata dal K ma non quella portata dal Na vuol

dire che i canali hanno caratteristiche diverse.

Questi canali se non passa più corrente vanno incontro ad

riguarda i inattivazione ovvero che dopo un po che rimangono aperti, questi si

canali del inattivano e nonostante il canale sia aperto ostruisce il canale del

sodio -> passaggio degli ioni. Per arrivare alla corrente nera si fa una differenza

per ogni punto tra la curva rossa (portata dal sodio) e la curva verde

(portata dal potassio).

ESPERIMENTO CARDINE SU VOLTAGE-CLAMP E POTENZIALE D’AZIONE

Gli amplificatori differenziali utilizzati erano dei residui bellici. Hanno utilizzato l’assone

gigante di calamaro. Nel calamaro ci sono 2 nervi che percorrono tutta la struttura del

mantello e sono quei nervi che permettono la propulsione per l’attacco e la fuga. Il

vantaggio è che è un assone GIGAN