Epidemiologia molecolare, biostatistica e bioinformatica

INTRODUZIONE

• L’obiettivo dell’epidemiologia molecolare non è solo quello di classificare i microrganismi, ma soprattutto di

identificare:

• Gli agenti responsabili delle patologie

• Le loro fonti e reservoirs

• Le relazioni biologiche e patogenetiche

• Le vie di trasmissione

• I geni responsabili della resistenza ai farmaci

• I geni importanti ai fini dello sviluppo di vaccini

•

TIPIZZAZIONE COMPARATIVA

Utilizzata per lo studio dei microrganismi in un definito contesto.

Pagina 51 di 104

Epidemiologia molecolare

Valutazione se ceppi (isolates) provenienti da matrici biologiche diverse (es.latte, cute) sono simili o meno.

IDENTIFICAZIONE DELLE FONTI D’INFEZIONE

Applicazione più tipica e frequente in Medicina Veterinaria soprattutto nell’ambito dei focolai di malattie infettive e di

tossinfezione alimentare.

- Trasmissione animale-uomo, uomo-animale, animale-animale

- Trasmissione ambiente-alimento (contaminazione)

In questo contesto sono di interesse tutti i meccanismi di trasmissione sia a livello di geografico (nazione, regione etc.)

sia a livello di allevamento.

- Trasmissione di patogeni contagiosi

- Trasmissione di agenti zoonosici

STUDI SULLA PERSISTENZA, REINTRODUZIONE E REINFEZIONE

La distinzione tra nuova infezione e reinfezione è uno degli argomenti più dibattuti in Med.Vet.

- Problema della valutazione dell’efficacia terapeutica (aspetti terapeutici)

- Problema della definizione della cronicità dell’infezione (curare o eliminare)?

- Problema di biosicurezza

SPECIFICITÀ DELL’OSPITE E NICCHIE ECOLOGICHE

La specificità dell’ospite e le eventuali modificazioni di tale specificità sono importanti sia nell’ambito delle zoonosi che

dello sviluppo di piani vaccinali —> Salmonella e Patogeni emergenti.

SVILUPPO DI VACCINI

• Identificazione dei geni principali coinvolti nella patogenesi delle malattie

• Possibilità di identificare eventuali geni candidati per la delezione (marker)

• Possibilità di sviluppare vaccini “ricombinanti” o proteici

Hot topics in Medicina veterinaria

• Test diagnostici aggiornati (soprattutto x sorveglianza animali ed alimenti)

• Sviluppo di vaccini (soprattutto marker) Aggiornamento dei vaccini attuali

Comprensione della patogenesi delle malattie

Conoscenza delle interazioni con sistema immunitario

• Riduzione dei trattamenti antibiotic

• Zoonosi emergenti e riemergenti ZOONOSI EMERGENTI E RIEMERGENTI

S.AGALACTIAE E ANIMALI

- Molte specie animali possono essere infettate con GBS + trasmissione al feto

- Importante impatto economico per industria lattiero-casearia e dell’acquacoltura

- L’emergenza di GBS si è verificata in concomitanza con i cambiamenti nelle pratiche di allevamento, come

l'uso di mungitrici meccaniche o l’intensificazione dell'acquacoltura commerciale

Cosa ci dice LA GENETICA

Nel Regno Unito, negli Stati Uniti e in Portogallo solo il complesso clonale CC 61 predomina nei bovini.

Questa osservazione, unita all'assenza di CC61 tra i ceppi GBS umani, ha alimentato la percezione che questo lignaggio

GBS è specifico per i bovini.

Cosa ci dice LA PRATICA

- GBS CC61 è stato eliminato mediante programmi di controllo della mastite in molti Paesi con successiva insorgenza di

GBS da altri lignaggi, forse come risultato di salto di specie (uomo —> bovino)

Salto suggerito anche per GBS nei pesci

-

Perché si pensa AL SALTO DI SPECIE?

Pagina 52 di 104

Epidemiologia molecolare

- I ceppi CC1 sono frequentemente isolati dall’uomo sia in caso di patologie sia da portatori, ma non da bovini.

In Nord Europa (SE e DK) CC1 sono stati isolati da casi di mastite bovina negli ultimi anni con presenza di

focolai (facilitate da uso robot di mungitura).

- Ceppi CC103/314 sono ceppi tipicamente isolati nell’uomo soprattutto in Estremo oriente, ma ora ritrovati

anche in bovini di paesi Europei e Sudamericani.

- Il 90 % di CC1 e il 40% di CC103/314 sono portatori del gene per la resistenza alle tetraclicline (TcR).

Tetracicline non usate nel bovino (mastite) e gene praticamente assente nei ceppi CC61. Presenza di TcR nei

GBS bovini, indicatore di una probabile origine umana.

- L’operone per il lattosio sempre presente nei ceppi bovini. Lac 2 codifica per il metabolismo del lattosio ed è il

principale gene per l’adattamento dei GBS alla ghiandola mammaria GBS; generalmente assente nei ceppi

umani. La distribuzione eterogena di tale operone oltre che all’integrazione in siti diversi suggerisce che la sua

integrazione ha permesso il salto di specie da uomo a bovino.

Fino al 1980 sono stati isolati vari ceppi ma dal 1980 al 2000 circa non sono stati trovati alcuni. Mentre dal 2000 in poi

sono stati trovati nuovi ceppi, anche di altre specie.

La probabilità di un salto di specie da uomo a bovino è doppia rispetto al processo inverso (analisi genetiche).

La presenza di TcR e di Lac2 suggeriscono che GBS possono acquisire geni che ne favoriscono la diffusione in specie

diverse.

… non dimentichiamoci dell’acqua-coltura e dei rischi di diffusione ambientale (acqua).

SORVEGLIANZA & CONTROLLO

• OIE (WORLD Organization for Animal Health) 20

o Aumento della frequenza di focolai di malattie diffusive a livello transnazionale (TAD)

o Colpiti tutti I continenti con costi enormi

o UK 2001: FMD 4.5 mld € costi diretti + 7.5 mld € costi indiretti

• Lo sviluppo di nuove e più efficienti tecniche diagnostiche è un requisito essenziale nella ricerca veterinaria e

nella gestione della sanità animale

• Tali tecniche sono essenzialmente basate su metodiche molecolari (genomica e proteomica)

• New and Emerging Technologies: Improved Laboratory and On-Site Detection of OIE List A Viruses in Animals

and Animal Products (Lab-on-site Project)

• Sviluppo di nuove metodiche e definizione di procedure standardizzate da applicarsi a livello internazionale

• Foot-and-mouth disease FMD

• Swine vesicular disease SVD

• Vesicular stomatitis VS

• Classical swine fever CSF

• African swine fever ASF

• Bluetongue BT

• African horse sickness AHS

• Newcastle disease ND

• Highly pathogenic avian influenza HPAI

—> pressione biologica dovuta al fatto che anche se elimino una fetta degli animali infetti ci sarà sempre una porzione

di animali che rioccuperà quella nicchia di infetti -> si creeranno mutazioni.

VACCINI: MONITORAGGIO E SVILUPPO

La comprensione della variabilità genetica dei patogeni e come questa viene modulata della risposta immunitaria, le

vie di trasmissione, la dinamica delle infezioni e la struttura della popolazione sono essenziali per lo sviluppo di misure

di controllo efficaci.

In un contesto troppo ricco o troppo povero, lo sviluppo di vaccini è difficile per motivi economici. Nel primo contesto,

ci devono guadagnare; mentre, nel secondo è un altro paese a doversi prendere le responsabilità per quel paese

povero (malattie negleted).

Esempio tipico in Medicina è il virus dell’influenza, l’influenza equina, la FMD (afta) e la Bluetongue.

INFLUENZA EQUINA

Inizialmente abbiamo delle epidemie negli equini nel ’62 e nel ’63 sotto lo stesso ceppo. Sono stati sviluppati vaccini e

ad un certo punto c’è stata una rottura d’immunità, ovvero soggetti vaccinati si sono comunque infettati.

Pagina 53 di 104

Epidemiologia molecolare

Successivamente, è stato riconosciuto il problema della deriva dei virus

(ceppo distinto rispettivamente USA e Europa) -> ulteriore deriva tra Nord

America e Sud America.

Ciò significa che bisogna mantenere l’animale nella stessa area posso pensare

di vaccinarlo -> ma se lo trasporto in un’altra area dove ci sono altri ceppi e

non è vaccinato per quei ceppi allora si ammala.

RISPOSTA IMMUNITARIA: reazione crociata, 4 ceppi diversi confrontati con

loro stessi, i titoli molto diversi.

Il vaccino sviluppato con pochi ceppi avrà efficacia diversa ed inferiore quando

infezione sarà dovuta a ceppi geneticamente diversi —> risposta anticorpale

sarà più bassa.

Ridefinizione dei ceppi virali da utilizzare nei vaccini, tenuto conto che:

o Diversità antigenica e deriva dimostrata

o Cavalli da competizione viaggiano molto

• Necessario monitoraggio continuo focolai di influenza e risposta anticorpale su ceppi di riferimento

→Aggiornamento costante dei vaccini da utilizzare in campo

IL CASO DEL VIRUS BVD

• Pestivirus: Virus della diarrea virale bovina

• Identificato per la prima volta nel 1946

• Inizialmente associato a patologie gastroenteriche

• attualmente associato a problemi soprattutto di natura

riproduttiva

Probabilmente nelle fasi di produzione del vaccino ci sono state delle

modificazioni da parte del virus (vivo attenuato) e hanno

introdotto nel vaccino anche una porzione dell’altro ceppo. Ciò ha

portato il virus al ritorno allo stato nativo a causa della stessa

ricombinazione. SICUREZZA ALIMENTARE

Divenuta una priorità “politica” dopo episodio BSE, anche se i principali problemi sono altri:

- E.coli O157:H7

- Salmonella

- Campylobacter

- Listeria

- etc.

Abbiamo bisogno di classificare i miei agenti aptogeni in modo tale poter capire da dove derivino e applicare le giuste

misure.

Elemento chiave per studiare gli episodi di tossinfezione alimentare (food-borne outbreaks) e quindi prevenirli è

l’indagine epidemiologica

Il ruolo chiave è svolto dalle indagini di laboratorio mirate a tipizzare (classificare) i patogeni isolati in corso di

focolaio:

I METODI FENOTIPICI tradizionali quali biotipo, serotipo, tipizzazione fagica, antibiogramma forniscono

-

informazioni insufficienti ai fini epidemiologici.

I METODI MOLECOLARI stanno soppiantando i metodi fenotipici.

-

Tuttavia, per molti di questi metodi non vi sono procedure standardizzate applicate a livello internazionale.

Metodica molecolare considerata standard per alcuni alcuni ceppi —> Elettroforesi.

• PFGE in un episodio di tossinfezione alimentare dovuto a contaminazione di pomodori da parte di Salmonella

enterica.

• Posso anche creare microarray per geni (sapendo origine, posso vedere se ceppo più prevalente in ambito

animale, bovino, umano ecc e posso capire quale sia la fonte; E.Coli O157:H7)

Pagina 54 di 104

Epidemiologia molecolare

Alcuni geni di patogenicità sono presenti con maggiore frequenza in ceppi umani rispetto ai ceppi animali.

Anche importante mirare la ricerca sui fattori di patogenicità in modo da individuare anche la pericolosità del ceppo