Biologia molecolare eucariotica

ESPERIMENTI

L'esempio a lato è stato uno dei primi gel che ha messo in luce come i TF basali interagiscono sui promotori e reclutano la RNA polimerasi. Si tratta di un saggio EMSA in cui viene valutato lo shifting della mobilità elettroforetica; si andranno ora ad analizzare le varie lane.

Per prima cosa è stata presa una sequenza di DNA corrispondente ad un promotore di Adenovirus, ed è stata marcata; questo DNA marcato corre come la banda più in basso che si può vedere in molte lane, indicata con una freccia nella lane 1 (non è stato caricato sul gel un campione privo di proteine).

Al DNA promotore viene poi aggiunto il fattore TFIID e TFIIA. Quello che si osserva è che la banda "shifta" ad una velocità di migrazione diversa, e non compare più quindi solo il promotore libero, ma compare anche il complesso DNA-D-A (lane 1).

Successivamente sono stati aggiunti al DNA i tre promotori TFIIA, D e B insieme.

Si osservò uno shifting della mobilita elettroforetica e quindi la comparsa di un’ulteriore banda (lane 2, la nuova banda è indicata dalla freccia DAB). Si forma quindi il complesso D-A-B- DNA, che determina lo shifting; questo vuole dire che tutti e tre i fattori, in presenza del promotore di Adenovirus, sono in grado di legarsi.

Oltre a TFIID, A e B, è stato poi aggiunto anche TFIIF (lane 3). Non è osservabile nessun tipo di shifting rispetto alla lane 2, e questo vuole dire che F da solo non è in grado di legare il promotore di Adenovirus.

Viene quindi messo in luce che TFIIF non è un fattore in grado di legare il promotore da solo, ma necessita di un’altra componente. Questa componente è l’RNA polimerasi II, che viene aggiunta a partire dalla lane 4 fino alla lane 7 in quantità crescenti. Si è osservato che, in presenza di TFIIF e quantità crescenti di RNA polII, si ha la formazione di un complesso.

peso molecolare maggiore, e questo va a dimostrare che TFIIF eRNA pol II sono in grado di legare insieme il complesso precedente formato da TFIID-TFIIA-TFIIB-DNA.

Osservando le lane 4-7 si può capire che concentrazioni crescenti di RNA pol II fanno sì che ci sia shifting della banda, fino alla quasi totalità, verso il complesso D-A-B-DNA-F-PolII; il solo fattore TFIIF, invece, non provoca uno shifting ulteriore, e quindi non è in grado di legarsi da solo al complesso.

Aggiungendo TFIIF e RNA pol II al complesso D-A-B-DNA non si forma un unico complesso; osservando bene (è visibile soprattutto nella lane 4) sono visibili due bande ad elevato peso molecolare che corrispondono a DAB-Pol-F e DB-Pol-F (indicate dalle frecce) e questo è dato dal fatto che il fattore A può essere o meno presente senza influenzare la formazione del resto del complesso. Questo si può dimostrare anche osservando la lane 15 (vedi dopo).

A questo punto si è

Tolto TFIIF. Con concentrazioni decrescenti di F (da lane 8 a lane 12) si ha lo spiazzamento del complesso D-A-B-DNA-F-PolII, che pian piano torna ad essere di nuovo il complesso D-A-B-DNA (man mano che F cala, la RNA polimerasi si stacca). È stato dunque dimostrato che, affinché TFIIF si leghi, è necessaria RNA polimerasi, e che se TFIIF non è presente allora anche RNA polimerasi si stacca; questa evidenza dimostra che RNA polimerasi II viene reclutata sul promotore solo se complessata con TFIIF (si possono considerare come un' unica entità che viene reclutata insieme a livello del promotore). Poi dal complesso interno D-A-B-DNA-F-PolII, è stato tolto solo D (lane 13). Si è osservata la completa perdita di qualsiasi tipo di interazione con il DNA da parte di tutti i fattori, dimostrando come TFIID sia il fattore chiave per il reclutamento di tutti gli altri fattori trascrizionali e di RNA pol II. La stessa cosa è stata fatta

Togliendo B (lane 14). In questo caso si aveva comunque la formazione del complesso D-A-DNA, dimostrando che TFIIB non è determinante per il loro reclutamento sul promotore. Ciò che è stato però osservato, è che in assenza di TFIIB non si aveva il reclutamento di TFIIF e RNA pol II sul DNA, dimostrando così che TFIIB è indispensabile per il loro reclutamento.

Infine, fu tolto solo TFIIA (lane 15). Questo non comportò alcuna variazione nella formazione del complesso (se non per l'assenza di TFIIA), andando a confermare che il fattore A è il fattore meno indispensabile nell'assemblaggio della struttura.

L'ultima lane (16) contiene tutti i vari fattori e coincide con la lane 7. Rappresenta quindi la presenza del complesso totale.

Questo EMSA ha quindi messo in luce come un DNA promotore di Adenovirus venga riconosciuto in maniera sequenziale da una serie di fattori, e come questi fattori abbiano una certa importanza.

1) È stato fatto, sullo stesso promotore, un saggio di DNasi1- footprinting. È stato preso il promotore, è stato marcato con un fosforo radioattivo ed è stato incubato o con il complesso TFIID-TFIIA-TFIIB (lane 2) o con il complesso TFIID-TFIIA-TFIIB-Pol-TFIIF (lane 3) o con niente (lane 1).

È stato osservato che se il DNA veniva incubato senza proteine (lane 1), si generava un pattern di bande in cui ogni banda rappresentava un sito di taglio della DNasi a livello del singolo nucleotide (la diversa intensità di fluorescenza dipende dalla marcatura, che nella DNasi footprinting tende a generare bande più o meno intense, e non tanto dalla quantità).

Se invece il DNA veniva incubato con TFIID-TFIIA-TFIIB (lane 2), si poteva notare che veniva protetta dal taglio della DNasi una regione che va da -42 a -17 rispetto al sito di inizio dellatrascrizione; siccome il promotore di Adenovirus ha una sequenza nota,

contatto complesso-DNA. Se il promotore non avesse la TATA box bisognerebbe fare delle prove per vedere dove il complesso D-A-B interagisce, in questo caso l'esempio era un tipico promotore con TATA box.

Domanda: a cosa è dovuto il fatto che le bande nella lane 3 (in riferimento all'immagine 5) sono più intense?

Se il tempo di incubazione è lo stesso, la DNasi tenderà a tagliare più frammenti in corrispondenza delle stesse porzioni che sono rimaste ad essa accessibili. Se la quantità di DNA inserita è la stessa (si supponga 1µg in ogni lane), mentre nella lane 1 il segnale di 1 µg di DNA è suddivisa su 60 bande (quindi l'intensità disegnale va divisa per 60), nella lane 3 l'intensità di segnale dovrà essere divisa per un numero molto minore di bande (circa 20) e quindi queste risulteranno più intense. Esistono dei software che permettono di sommare le intensità di

Segnale delle varie bande di ogni lane, e quello che si dovrebbe ottenere è lo stesso valore per ogni lane; bisogna sempre però considerare che la corrispondenza intensità-concentrazione non è perfetta. Il fatto che le bande a valle siano meno intense di quelle a monte non è significativo.

Domanda: è indifferente l'uso di marcatori radioattivi o fluorescenti?

La marcatura si può fare in entrambi i modi, l'unica cosa fondamentale è che la marcatura sia fatta solo ad una estremità del frammento; la scelta dipende dal sistema di rivelazione che si usa. Se si ha a disposizione un sistema per la misurazione della fluorescenza è meglio, siccome permette di evitare di lavorare con il radioattivo, ma allo stesso tempo è molto più costoso. Di solito si usa il radioattivo appunto perché è più economico e permette di visualizzare anche quantità molto piccole (anche pochi ng) che con.

La fluorescenza non sarebbero visibili (necessita almeno di circa 200ng). Circa 15 anni fa i radioattivi venivano usati per sviluppare le lastre fotografiche, utilizzando i liquidi di sviluppo comprati da fotografi; ad oggi si usano degli scanner. Per la fluorescenza servono invece macchine apposite per misurare l'emissione di fluorescenza alla lunghezza d'onda del fluoroforo utilizzato.

Domanda: Per correre un gel di EMSA rispetto ad un gel di footprinting le condizioni di corsa devono essere diverse?

Risposta: Sì, perché mentre nell'EMSA è necessario mantenere l'interazione DNA-proteina, e quindi si mantengono condizioni non denaturanti, nel caso del footprinting, se vogliamo correre senza aver precedentemente separato le proteine dal DNA, sono necessarie condizioni denaturanti, perché si deve vedere la corsa dei frammenti di DNA e la presenza di proteine sui frammenti che potrebbero interferire con la migrazione. In alternativa alle