Appunti di Biologia molecolare eucariotica

I II

tipo tipo

• •

si lega a boxe e richiama TFIIIC sul

TFIIIA a una

riconosce boxB, ma si lega

TFIIIC

AL

DNA. TFIIIC polimerizza lungo il DNA. anche

regione estesa che comprende

più

punto d'inizio richiama TFIIIB boxA

In entrambi i casi il legame di TFIIIC richiama TFIIIB che si lega a una sequenza

al punto d'inizio. La presenza di TFIIIB è sufficiente perché la RNA poi III si

intorno

al punto d'inizio. TFIIIB consiste di TBP e di altre due proteine; la subunità TBP

leghi

interagisce direttamente con la RNA poi.

Quindi possiamo dire che TFIIIB è l'unico vero fattore d'inizio ("positioning

factor"), mentre TFIIIA e TFIIIC sono fattori di assemblaggio.

Il terzo tipo di promotori della RNA poi III (promotori per snRNA, a monte)

contiene tre elementi che si trovano anche nei promotori per i geni degli snRNA

trascritti dalla RNA pol II (geni per alcuni snRNA sono trascritti dal pol II, altri dalla

pol III)

1. il suo riconoscimento da parte di una fattore che include la

TATA box: TATAArrA

TBP è sufficiente per l'inizio della trascrizione, ma l'efficienza è molto aumentata

dalla presenza degli elementi:

=proximal sequence element)

PSE (

2.

3. (=octamer): sequenza ottamerica prima di direzionalità. (Vedi anche

OCT

promotori senza TATA della pol II) Un principio

I fattori che si legano a PSE e OCT agiscono in modo cooperativo.

generale è che questi fattori si legano al promotore prima che si leghi la RNA pol,

che dirige il legame dell'enzima.

perciò formano un complesso di pre-inizio

II:

Struttura dei promotori della RNA poi "mix and match",

I promotori della poi II sono organizzati secondo il principio del

per cui una grande varietà di elementi può contribuire alla funzione del promotore e

nessun elemento è essenziale per tutti i promotori. La natura modulare dei promotori è

dimostrata da esperimenti in cui regioni equivalenti di promotori diversi sono state

scambiate, generando promotori ibridi ancora funzionali. Anche i TF hanno natura

di

modulari con domini indipendenti con funzioni separate (vedi più avanti esperimento

"domain-swap LexA-Gal4).

Ciò suggerisce che la funzione essenziale degli elementi di un promotore sia di

portare i fattori che legano nelle vicinanze del complesso d'inizio, dove le interazioni

proteina-proteina determinano l'efficienza della reazione d'inizio.

Lo schema generale di un promotore della RNA pol II consiste di 2 tipi di regioni:

1. Elementi basali, che determinano la posizione del punto d'inizio:

25

a) Al punto d'inizio non c'è un'estesa omologia di sequenza, ma di solito la

A,

prima base dell'mRNA è una fiancheggiata da pirimidine (Te C).Questa

"iniziatore " (InR),

regione è detta si estende dalle basi -3 a +5 e può essere

descritta dalla forma generale:

5' 3'

Y-Y-A+1-N-T/A-Y-Y-Y

Per Y si intendono le pirimidine e per"+ l" la prima base trascritta.

Un promotore che contenga solo Inr si trova nella forma più semplice

IL

possibile riconoscibile da una pol

La

b) maggior parte dei promotori della pol II contengono anche una sequenza

TATA box

consenso detta a -25 dal punto d'inizio. Questa sequenza

costituisce l'unico elemento a monte ad avere un loco relativamente fisso

relativamente al punto d'inizio. Consiste di 8 bp di A-T, circondata da

sequenze ricche di G-C. La mancanza della TATA box non impedisce

l'inizio della trascrizione, ma il punto d'inizio varia dalla sua precisa

posizione usuale

2. Sequenze a monte, che influenzano la frequenza dell'evento d'inizio:

CAAT box:

a) centrato intorno a -75, ma può funzionare anche a distanze

maggiori. NB: funziona anche nell'orientamento opposto. Ha un ruolo

determinante nel l'aumentare l'efficienza del promotore. Può interagire

CTF (CPl e CP2), ma anche con i fattori

con i fattori della famiglia

C/EBP e ACF, a seconda del promotore.

Isole CpG: GC box:

centrato su - 90. Contiene la sequenza consenso

b) GGGCGG, che è spesso presente in copie multiple e anche nell'altro

fattore SPl.

orientamento. Questo elemento è riconosciuto dal

Sequenza ottamerica:

c) non ha direzionalità. Riconosciuta dal fattore

OCT. Si trova anche nei promotori del 3° tipo riconosciuti dalla pol III.

II

ASSEMBLAGGIO COMPLESSO D'INIZIO DA PARTE DEI TF BASALI DI POL

Promotori con TATA box:

TFIID (800 kD) a una regione a monte della TATA box.

1) legame del fattore

TFIID è formato da due componenti

• TBP TATA binding--protein (30 kD). Si lega al DNA nel solco minore. La

=

struttura cristallina della proteina mostra che questa circonda una faccia del

DNA, formando una specie di sella intorno alla doppia elica. La superficie

interna di TBP si lega al DNA, mentre quella esterna contatta altre proteine.

NB: il legame di TBP al DNA è incompatibile con la presenza di nucleosomi.

C, la TATA box si piega verso il

Il legame di TBP piega il DNA di ca 80°

26

solco maggiore, allargando il solco minore (la distorsione del DNA è limitata

alle 8 bp della TATA box). Il cambiamento dell'organizzazione spaziale del

DNA su entrambi i lati della TATA box permette ai fattori di trascrizione e

alla RNA pol di formare un'associazione più stretta di quella che sarebbe

il piegamento della TATA box

possibile se il DNA fosse lineare. NB:

corrisponde allo svolgimento di circa 1/3 di giro del DNA ed è compensato

da un superavvolgimento positivo.

• TAFs TBP associated factors. Alcune TAFs sono stechiometriche con

=

TBP, altre si trovano in quantità minori (sono tessuto.specifiche). TFIID con

diverse T AFs è in grado di riconoscere promotori diversi. T AF impedisce

2° fattore, TFIIA

l'inizio della trascrizione finchè non si lega il

TFIIA,

2) si lega che libera l'inibizione da TAF (in alcuni promotori a questo punto

si lega la topo I, che è in grado di attivare o reprimere alcuni geni)

TFIIB. Copre solo una parte della doppia elica, quindi costringe la pol II a

3) si lega

legarsi dall'altra parte

TFIIF, che è composto da due subunità:

4) si lega

Rap74:

a) elicasi ATP dipendente (melting DNA)

Rap38: subunità che contatta la pol II

b)

TFIIF ha il compito di legare la pol II e di portarla sul promotore. Il complesso

TFIIF-RNA polsi lega al promotore nello spazio tra TFIIA e TFIIB

TFIIE. Si lega a valle della pol IL Ruolo non noto ma importante per

5) Arriva

l'inizio della trascrizione TFIU TFIIH.

6) Entrano in gioco i fattori e Non si sa cosa faccia il 1 °, mentre

TFIIH è molto importante perché se non si lega la pol II non inizia a sintetizzare.

E' l'unico fattore che si lega alla pol II e non si stacca più per tutta la durata della

trascrizione.

Ruoli TFIIH:

• ATPasi

• Chinasi

• Elicasi

• Riparazione DNA (vedere di seguito) vengono fosforilati 5

L'attività chinasica di TFIIH è esercitata su CTD:

residui del dominio (Tyr, Thr e tre Ser). Dopo che la coda è stata fosforilata tutti

i fattori di trascrizione si staccano dal complesso basale (tranne TFIIH) e si ha la

transizione da complesso chiuso a aperto e quindi l'allungamento. A CTD si

legano anche l'enzima guanilil transferasi (responsabile del capping) e alcuni

fattori di splicing, per cui si pensa che CTD abbia un ruolo importante nella

maturazione dell'RNA.

Promotori senza TATA:

La formazione del complesso basale è basata sul riconoscimento degli altri

elementi che formano il promotore (Inr, CAAT box, GC box, ottametro). In

particolare La TBP riconosce la sequenza Inr. La posizione dell'inizio della

trascrizione è più variabile in questo tipo di promotori.

27

Sistema di escissione riparo durante la trascrizione:

e

TFIIH riconosce un danno al DNA (dimeri di pirimidine, mismatches etc) e

recluta i fattori di riparazione UvrA e UvrB ( omologhi a quelli di E.Coli).

Quando la RNA poi incontra un danno nel filamento stampo si ferma perché è

impossibilitata a proseguire, mentre se il danno nel filamento copia questo non

è

impedisce il proseguimento della sintesi. Ciò spiega perché in un gene trascritto

il filamento stampo è preferenzialmente riparato in seguito a danno al DNA.

Def. ENHANCER: elemento che promuove la trascrizione e si differenzia dal

promotore nelle seguenti caratteristiche:

• La sua posizione relativamente al promotore può variare enormemente (a monte, a

valle ... Resta ancora da scoprire a che distanza dal promotore l'enhancer cessa di

funzionare. Il DNA forma un loop in modo che gli elementi in cis dell'enhancer

possano contattare i fattori basali al promotore)

• Può funzionare in entrambi gli orientamenti

• Può stimolare la trascrizione da ogni promotore che venga localizzato nelle sue

"vicinanze"

• Maggiore densità di elementi regolatori

• Ipersensibilità alle nucleasi (assenza nucleosomi)

• Ridondanza di funzioni (multiple mutazioni sono richieste prima che un enhancer

venga inattivato)

• Maggiore cooperatività tra il legame dei fattori (si parla anche di enhanceosoma)

Somiglianze dell'enhancer con il promotore:

• Sponsorizza trascrizione

• Elementi in comune (

es. APl e ottamero)

• Organizzazione modulare

• Funziona attraverso le stesse interazioni con l'apparato basale che intercorrono tra

gli elementi a monte del promotore e l'apparato basale

Elementi analoghi ad enhancer si trovano nel lievito, dove sono detti UAS =

upstream activator sequences -275

(si trovano a dal punto d'inizio).

di aumentare la concentrazione dei fattori di

Il ruolo essenziale dell'enhancer è

trascrizione nelle vicinanze del promotore. L'organizzazione del DNA deve essere

abbastanza flessibile per permettere all'enhancer e al promotore di trovarsi vicini. Nel

di enhancer batterici sono stati osservati i previsti "loop" del DNA tra l'enhancer e

caso

il promotore, che viene estruso.

Come funzionano i fattori di trascrizione eucariotici?

RECRUITMENT MODEL: reclutano la DNA pol sul sito d'inizio.

Ga14. Attivatore trascrizionale con natura modulare: DNA binding domain

Es.

(Gal4[1-100]) separato dall'activating-c:I0main (Gal4[100-881]) da una regione di

connessioQe.

regioni di attivazione sono due, dette ARI e ARII (circa 100 aa ciascuna), e

L