Biologia parte 2

unità di replicazione o REPLICONI.

REPLICONI : le origini di replicazione tendono ad essere attivate a gruppi, chiamate

Ogni replicone contiene circa 20-80 origini di replicazione. In ogni replicone , le forcelle di replicazione procedono in

senso opposto l'una all'altra, così non si incontrano.

Le regioni di un cromosoma si duplicano in diversi momenti del ciclo cellulare ( fase S) : l'eucromatina si replica per

prima, mentre l'eterocromatina si replica tardi, perchè più condensata e inacessibile.

NUCLEOSOMI : mentre il DNA viene duplicato, come si staccano gli istoni? Dove vanno?

L'ottamero istonico non si disfa, resta compatto e una parte sta attaccata al filamento stampo e un'altra parte si ancora

al filamento di nuova sintesi. Si ricompongono subito dopo il passaggio della forcella di replicazione.

Inoltre la replicazione del DNA necessita di nuovi istoni : è necessaria una grande quantità per produrre dei nuovi

nucleosomi e vengono sintetizzati sopratutto durante la fase S del ciclo cellulare, coordinati con la replicazione

cellulare. L'assemblaggio dei nuovi nucleosomi avviene subito il passaggio della forcella perchè il DNA non può stare

tanto a lungo srotolato, occupa spazio e non ci sta nel nucleo.

1. DNA elicasi srotola la doppia elica, preceduta dalle proteine SSB.

2. Formazione della forcella di duplicazione e bolla

3. sequenze di RNA primer fanno da innesco per dare inizio all'azione della DNA polimerasi.

4. DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento da 5' a 3', partendo da un'estremità 3'

5. sintetizza anche un nuovo filamento a scatti ( filamento in ritardo), formato dai frammenti di Okazaki.

6. Vengono tolti i primer ai frammenti, rimangono dei gap ( buchi) , riempiti da una DNA polimerasi I.

7. I pezzi “nick” sono poi saldati assieme da una DNA ligasi

MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA

Una mutazione genetica può essere dovuta a :

errori che si verificano durante la replicazione

✔ agenti chimici / fisici

✔

→ provocano alterazioni dell'informazione genetica, modificazione dei nucleotidi o rotture del DNA, nonché cambiamenti

permanenti che alterano la struttura del DNA.

Le mutazioni genetiche sono la fonte di variabilità del DNA, sono un elemento fondamentale per l'evoluzione.

indotte )

Possono essere spontanee oppure causate da agenti fisici, chimici e biologici ( mutazioni . Alcune mutazioni

possono essere patogene : possono essere la causa diretta di un'anomalia fenotipica o possono aumentare la

probabilità di insorgenza di certe malattie. Qualunque elemento presente nell'ambiente che aumenti in maniera

significativa il tasso di mutazione al di spora di quello spontaneo viene detto mutageno , possono essere di tipo fisico

( radiazioni ionizzanti, raggi UV ) e chimico ( analoghi di basi, agenti idrossilanti/alchilanti/ intercalanti).

I raggi X provocano rotture al doppio filamenti di DNA ( perdita di frammenti di DNA) , i raggi UV determinano il legame

covalente tra due pirimidine adiacenti dello stesso filamento , al posto del legame a idrogeno con l'altra base

complementare.

Espressione fenotipica alterata da :

Prodotto che non funziona

• prodotto che funziona parzialmente

• assenza del prodotto ( viene impedita la trascrizione di un gene o l'RNA viene degradato prima della

• trascrizione).

La maggior parte di danni al DNA sono temporanei , perchè vengono corretti da meccanismi di riparazione.

La fonte maggiore di danni spontanei è la duplicazione del DNA, in quanto può capitare che venga inserito un nucleotide

sbagliato, causando un errore di accoppiamento tra le basi detto “ mismatch “ , che se non viene riparato prima della

duplicazione del DNA viene trasformato in mutazione, le basi sbagliate possono essere eliminate o sostituite con altri

nucleotidi .

→DNA polimerasica

polimerasi : esistono vari tipi di polimerasi che hanno due attività catalitiche : attività ( aggiunta di

→ →

esonucleasica

nucleotidi da 5' 3') e attività ( rimozione dei nucleotidi per la loro correzione , va da 3' 5').

Proofreading : la DNA polimerasi corregge il mismatch. Nonostante questa attività, la DNA polimerasi può non

correggere correttamente alcuni errori.

MECCANISMI DI RIPARAZIONE : i diversi tipo di danni devono essere rimossi in modo molto efficiente dai sistemi

enzimatici di riparazione. Alcuni sistemi riconoscono le distorsioni dell'elica, altri localizzano il singolo nucleotide

errato. Le vie di riparazione sono numerose e ridondanti : la stessa alterazione può essere riparata da sistemi diversi

che agiscono in modo coordinato.

Metodi principali :

1. Revisione diretta della modificazione chimica responsabile del danno al DNA , riparazione diretta all'errore.

2. Rimozione del DNA danneggiato seguita dalla sostituzione con DNA di nuova sintesi ( rimozione di un tratto di

DNA dove è presente l'errore).

→

FOTORIATTIVAZIONE : la riparazione dei danni provocati dai raggi UV è effettuata dall'enzima fotoliasi , che assorbe

fotoni dalla luce e li usa come energia per rompere i legami covalenti tra due dimeri di timina, così si legheranno

all'adenina con legami a idrogeno. Azione diretta sull'errore.

→ RIPARAZIONE DEI DANNI DA ALCHILAZIONE : gli agenti alchilanti possono interagire con il DNA e aggiungere grupp

alchilici a livello delle basi azotate. Le metiltransferasi sono degli enzimi in grado di rimuovere questi danni.

Passaggi comuni per la riparazione di alterazioni chimiche del DNA :

1. Escissione : l'alterazione viene riconosciuta da un complesso enzimatico . Le endonucleasi rimuovono la

porzione alterata del filamento, resta un gap.

2. Risintesi : la DNA polimerasi riempie il gap utilizzando come stampo la copia corretta del filamento

complementare.

3. Legatura : la DNA ligasi sigilla il nuovo filamento e salda l'interruzione.

ESCISSIONI : le alterazioni ai nucleotidi sono riparate da diversi meccanismi di escissione e riparo, in base al tipo di

danno. Riparazione per escissioni di basi ( BER) :

→

meccanismo per la rimozione di basi modificate ( es deaminazione).

Intervengono una serie di enzimi DNA glicosilasi , in grado di riconoscere un tipo di base alterata e la rimuove rompendo

il legame con lo zucchero pentoso. Lo zucchero senza base viene riconosciuto e rimosso da particolari enzimi , le ap

endonucleoasi e fosfodiesterasi. Il gap viene ripristinato mediante una nuova sintesi e legatura da parte di DNA

polimerasi e ligasi.

Riparazione per escissione di nucleotidi (NER) :

è un meccanismo molto versatile e importante : rimuove danni che determinano grossi cambiamenti nella doppia elica

( es dimeri di timina, legami covalenti tra le due basi).

Un complesso multi-enzimatico scannerizza il DNA e cerca anomalie e distorsioni nella doppia elica . Dove trova delle

distorsioni effettua un taglio a monte e a valle del filamento danneggiato , ad opera di specifiche nucleasi. Il frammento

è svolto dalla doppia elica mediante DNA elicasi, il gap viene ripristinato mediante la nuova sintesi del filamento , con

successiva saldatura.

Riparazione dell'appaiamento errato ( mismatch repais MMR) :

Meccanismo di riparazione del DNA che corregge basi appaiate erroneamente e poi sfuggite alla correzione.

Il sistema mismatch repair riconosce la distorsione presente all’esterno dell’elica quando ci sono due nucleotidi non

correttamente appaiati ( riparazione per escissione). Ma come fa questo sistema a riconoscere il nucleotide “sbagliato”

nel filamento?

Dam metilasi metila i residui di adenina nella sequenza GATC.

• La metilazione avviene dopo la replicazione del DNA, quindi solo il filamento stampo è metilato.

• La metilasi aiuta a riconoscere la sequenza metilata.

• Riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB) :

Le rotture DSB sono provocate da radiazioni ionizzanti, agenti ossidanti, errori di replicazione e altro prodotti metabolici

della cellula. Le rotture a doppio filamento sono riparate mediante due diversi meccanismi

1) Riparazione mediante RICOMBINAZIONE OMOLOGA : dopo la replicazione si rompe un filamento , le due

estremità della rottura vengono accorciate e utilizzo il cromatidio fratello per sintetizzare la sequenza

omologa, il danno viene riparato accuratamente.

2) Riparazione mediante unione delle estremità NON OMOLOGHE : rottura del doppio filamento riconosciuta dalle

nucleasi, vengono degradate le estremità non appaiate e vengono uniti i filamenti , ma con la perdita di un tratto

di DNA. La perdita può essere innocua ( se vengono eliminate basi di poca importanza) ma potrebbe anche

provocare dei danni. La cellula sceglie di riparare un grosso danno commettendone uno piccolo e meno grave

rispetto alla mancata riparazione del danno .

Mutazioni somatiche: non vengono trasmesse alla progenie

Mutazioni germinali: vengono trasmesse alla progenie attraverso i gameti

Nella specie umana il tasso medio di mutazione per nucleotide per generazione e’ circa 18/miliardo, con ampia

variazione tra geni . Tale variazione è dovuta al fatto che la probabilità di mutazione spontanea dipende dalla

composizione nucleotidica del segmento di sequenza considerata. Esistono segmenti più mutabili di altri (“hot spots”).

MUTAZIONI PUNTIFORMI : variazione di una singola unità nucleotidica all'interno del genoma ( codificante e non ).

Tipi di mutazioni :

sostituzione di basi

➔ inserzione

➔ delezione

➔

Le mutazioni geniche sono variazioni della sequenza nucleotidica e di dividono in mutazioni per sostituzione di base

o per inserzione/duplicazione/delezione dette anche mutazioni frameshift. Tali mutazioni provocano un'errata

lettura del messaggio durante la traduzione, a partire dal punto della mutazione in poi. Il cambiamento può

riguardare una o poche basi; nel primo caso si parla, più propriamente di mutazioni puntiformi.

Le mutazioni possono colpire varie zone del

DNA , se colpiscono zone non codificanti

allora non ci sono conseguenze, ma possono

insorgere dei problemi se avvengono :

nel promotore

– nelle regioni 5' UTR e 3' UTR, che

– regolano l'espressione genica

sequenze di consenso o

– ramificazione dello splicing

sequenze introniche con attivo di un

– sito criptico di splicing.

Inserzione : Il filamento di nuova sintesi presenta una protrusione/ forcina e viene aggiunta una base in più.

Delezione : il filamento stampo presenta una protrusione/ forcina , la base non viene letta quindi non viene aggiunta

la base complementare.

Mutazioni puntiformi :

59% missense, nonsense

➢ 9.9 % mutazione siti di splicing

➢ 17% piccole delezioni

➢ 6 % piccole inserzioni

➢

in TOT sono il 93% delle mutazioni

Mutazione puntiforme

Una mutazione puntiforme è una variazione di sequenza del DNA che interessa uno o pochi nucleotidi.

Molte mutazioni puntiformi sono probabilmente senza effetto, in tal caso si dice che sono neutre, infatti gran parte

del DNA in un genoma eucariotico non codifica prodotti proteici.

Sostituzione di basi

Le mutazioni per sostituzione di basi determinano lo scambio di un nucleotide con un altro. Sono definite transizioni

qualora vi sia un scambio di una purina con altra purina (A > G) o di una pirimidina con un'altra pirimidina (C > T); si

dicono invece transversioni quando lo scambio è di una purina con una pirimidina o viceversa (C/T > A/G). In genere

le transizioni sono più frequenti delle transversioni.

Le mutazioni puntiformi possono essere di sei tipologie: silenti, missenso, delezioni o inserzioni in frame, inserzioni

nonsenso, mutazioni frame-shift o mutazioni di splicing.

Le mutazioni silenti o sinonime si verificano quando la sostituzione di una base azotata in una sequenza di

• DNA non determina variazione della sequenza amminoacidica della proteina interessata, a causa della

ridondanza del nostro codice genetico che è degenerato (gli stessi aminoacidi possono essere codificati da

più triplette). Le mutazioni silenti sono in prevalenza neutre poiché l'amminoacido non cambia e di

conseguenza non cambia neppure la funzionalità della proteina codificata all'interno della quale si trova la

tripletta mutata.

Le mutazioni missenso si verificano quando all'interno di una sequenza di DNA viene sostituita una base

• azotata in modo tale che la sequenza amminoacidica sia modificata. Questo tipo di mutazioni può essere

neutra e non determinare nessun fenotipo specifico rappresentando semplicemente un polimorfismo a

singolo nucleotide (SNP) o una variante privata, ma può anche dare origine a patologie gravi come l'anemia

falciforme. Spesso anche una singola mutazione in una regione altamente conservata di una proteina le fa

perdere funzionalità.

Le mutazioni nonsenso si verificano quando una mutazione ad un nucleotide di una tripletta determina la

• trasformazione di un codone codificante un amminoacido in un codone di stop. La conseguenza è la

proteina codificata non viene esportata oppure, se codificata, è tronca, poiché la traduzione si conclude al

codone di stop ignorandone le triplette a valle. La conseguenza di questa mutazione è una proteina tronca

non funzionale o nociva.

Le delezioni in frame e le inserzioni in frame determinano rispettivamente l'eliminazione di una tripletta o

• di un numero di nucleotidi divisibili per 3 oppure l'inserzione di una tripletta o di un numero di nucleotidi

divisibili per 3. Sono "in frame" poiché non spostano la cornice di lettura a livello ribosomiale. Questo tipo

di mutazioni determinano l'eliminazione o l'aggiunta di amminoacidi nella proteina codificata a partire

dall'mRNA maturo che le contiene. Le conseguenze di queste mutazioni sono molto varie.

Le mutazioni frame-shift sono dovute a delezione o inserzioni di un numero di nucleotidi non divisibile per

• 3, questo comporta lo spostamento della cornice di lettura a valle della mutazione e quindi la codificazione

di una sequenza amminoacidica non corrispondente a quella del trascritto originario. La conseguenza è la

produzione di proteine anomale che hanno solo porzioni di sequenza corrispondenti all'originaria o la

mancata esportazione o traduzione dell'mRNA mutato.

Mutazioni in regioni regolatrici della trascrizione :

Le mutazioni non hanno un grande effetto nelle zone non codificanti, a meno che non colpiscano zone particolari

come regioni splicing ( rimozione di introni) o zone per la regolazione delle trascrizione. Ciò può determinare

conseguenze molto variabili che vanno da nessun effetto fenotipico a cambiamenti dell'espressione genica che

danno origine a gravi patologie.

In conclusione, a causa dei processi di mutazione dovuti sia a cause intrinseche alle proprietà del DNA o dei

cromosomi, sia a cause estrinseche (effetto mutageno di agenti fisici o chimichi), le sequenze del DNA genomico

vengono parzialmente modificate in ogni generazione. Dal punto di vista quantitativo, tali modificazioni sono quasi

insignificanti rispetto al totale del DNA genomico (oltre 3.000 Mb), ma può bastare la modificazione di un singolo

nucleotide per alterare significativamente la funzione di un gene

I GENI : regione di DNA trascritta in una sequenza complementare di RNA. ( mRNA, tRNA, rRNA ecc).

Il numero di geni presenti negli organismi viventi non ha una diretta relazione con la complessità dell'organismo, e

varia in ogni specie vivente.

→

Le cellule procariote non contengono sequenze non codificanti

→

cellule eucariote contengono molte sequenze non codificanti ( introni) e qualche breve zona codificante (esoni).

Il trascritto primario di RNA viene modificato per rimuovere le sequenze introniche con un processo di splicing :

rimozione degli introni e unione degli esoni.

→ →

RNA primario splicing RNA maturo.

Ciascun gene è associato ad una regione regolatoria : portano l'informazione di quanto il gene deve essere tradotto

e con quale velocità e in che momento ( fase fetale, risposta ad un segnale..). L'efficienza della trascrizione è

regolata da queste particolari sequenze che controllano che avvenga al momento giusto e nel giusto tipo di cellula.

Alcune zone del gene sono chiamate “ promotore” , sono sequenze regolatrici che legano con specifiche proteine

non istoniche ( fattori di trascrizione), che favoriscono o bloccano la trascrizione del gene.

Quantità di DNA nel genoma : gli organismi eucarioti possiedono più DNA dei procarioti.

Solo una piccola parte del DNA eucariota è codificante, il 20-50% è composto da sequenze ripetute ( DNA ripetitivo) ,

presenti ad esempio nei telomeri e centromeri.

→

codificante : geni per proteine e ribosomi

→

DNA ripetuto e DNA a sequenza singola

geni 57 kb

introni 6 kb

esoni 280 pb

Numero medio di esoni 11

Dimensione media mRNA 3 kb

Dimensione media proteine 540 aa

Codificano la maggior parte per : enzimi, trasduzione del segnale, legame con gli acidi nucleici, molecole di

adesione e trasporto.

Alcuni geni sono presenti in coppie multiple, identiche o variabili, e possono essere raggruppati o dispersi nel

genoma in : ( sequenza di un gene ripetuta più volte)

gruppi ripetuti identici ( istoni)

• gruppi ripetuti variabili ( famiglia genica).

•

I singoli geni di una famiglia genica codificano per proteine diverse , ma con funzione correlata tra loro.

1. DNA a sequenza unica : geni codificanti per mRNA., presenti in singola copia.

2. DNA mediamente ripetitivo : geni codificanti per rRNA e tRNA.

È una classe molto eterogenea , può essere ripetuta10 volte o anche 100.000 volte.

È distribuito lungo tutta la lunghezza dei cromosomi e in genere alternato con sequenze uniche. La

maggior parte del DNA mediamente ripetuto viene trascritta, ma non tradotta : codifica per rRNA e tRNA.

Una piccola parte viene trascritta in mRNA e tradotta in proteine : geni codificanti per gli istoni. La funzione

del DNA mediamente ripetuto :