Biologia parte 2

ENZIMI PER LA MANIPOLAZIONE DEL DNA :

Nucleasi : tagliano, accorciano o degradano molecole di acidi nucleici.

✔ Si distinguono in Esonucleasi : rimuovono un nucleotide alla volta dalle estremità (entrambe le

estremità oppure soltanto dal terminale 3')

Endonucleasi : tagliano i legami fosfodiesterici interni del DNA (frammenti).

Polimerasi : producono copie di molecole di acidi nucleici

✔ Enzimi di modificazione : rimuovono/aggiungono gruppi chimici

✔ Ligasi : uniscono molecole di acidi nucleici

✔

Le endonucleasi sono degli strumenti molto importanti nell'ingegneria genetica perchè sono in grado di tagliare il

DNA in modo preciso. Hanno un ruolo importante nella difesa contro le infezioni virali (restrizione controllata) :

quando il virus inietta il suo DNA virale nella cellula, questi enzimi lo riconoscono e tagliano in specifici tratti in

modo da disattivarlo. Ma come fa a non metilare il DNA batterico? Viene protetto attraverso la metilazione delle

sequenze di riconoscimento (4-8 basi palindrome, cioè con la stessa sequenza nucleotidica se lette in direzione 5'-

3' in entrambi i filamenti).

Le endonucleasi sono degli enzimi che possono riconoscere precise sequenze nucleotidiche , a cui si legano

operando il “taglio”. Queste sequenze sono dette “siti di restrizione”.possono tagliere i filamenti di DNA in due

modalità:

→ estremità piatte : il filamento viene tagliato in modo netto e simmetrico

→

estremità sporgenti : il filamento viene tagliato in modo sfalsato e asimmetrico , si generano le estremità

appiccicose.

Se un frammento di DNA deve essere inserito in un altro genoma , le sue estremità devono essere compatibili con le

altre. Il materiale genetico viene digerito con gli stessi enzimi di restrizione così ottengo delle estremità uguali che

potranno appaiarsi tra loro.

Le polimerasi sono enzimi che sintetizzano il nuovo filamento di DNA complementare ad uno stampo di DNA/RNA.

Possono funzionare solo se lo stampo possiede una regione a doppio filamento che agisce da primer.

La DNA polimerasi I , si lega ad una regione a singolo filamento (nick) , sintetizza un filamento nuovo e degrada

quello vecchio. La rimozione del segmento di DNA pol I che contiene attività nucleasica, produce un enzima

modificato che riempie il nick ( frammento di Klenow).

Tecnica del DNA ricombinante :

1. Isolamento del gene dal genoma tramite enzimi di restrizioni che tagliano la sequenza specifica che mi

occorre.

2. Utilizzo lo stesso enzima di restrizione per tagliare il genoma “ospite”, le estremità coesive si legano

appaiando le basi azotate.

3. I legami a idrogeno non sono sufficienti , interviene una DNA ligasi per garantire la saldatura tra i

frammenti

4. ottenimento del DNA ricombinante.

Vettori di clonaggio : sono i trasportatori del DNA selezionato all'interno della cellula ospite , per un suo stabile

mantenimento. Si usano spesso i plasmidi, elementi genetici naturali dei batteri costituiti da una molecola di DNA a

doppio filamento. Sono facili da utilizzare perchè sono piccoli e maneggevoli, penetrano facilmente nelle cellule

batteriche e sono molto compatibili con esse. Hanno la capacità di autoreplicarsi grazie alla presenza di un'origine

di replicazione. Questi vettori vengono ingegnerizzati per possedere una regione “poly linker” in cui sono

raggruppati molti siti di restrizione. Questo sito poly linker può essere contenuto nella regione codificante di un

gene la cui attivazione inserzionale può essere facilmente identificata, ma non deve mai interrompere geni

fondamentali per la funzionalità del plasmide. Nel vettore il sito poly linker è compreso tra un gene promotore e

uno terminatore.

PCR : reazione a catena della polimerasi : È un sistema di clonaggio in vitro con la quale si possono ottenere molte

copie di specifiche sequenze di DNA molto rapidamente. La PCR richiede l'uso della DNA polimerasi, l'enzima che si

occupa della duplicazione del DNA, e una fornitura di nucleotidi per la formazione del nuovo DNA.

Questo meccanismo si basa sul principio della replicazione del DNA, ho la possibilità di generare primers specifici e

replicare molte volte uno specifico frammento di DNA per poi analizzarlo, sequenziarlo o utilizzarlo.

OCCORRE :

DNA stampo

• Oligonucleotidi primer: per l'innesco della reazione, è necessario conoscere almeno una sequenza del

• frammento da amplificare.

DNA polimerasi termoresistente.

• Miscela dei 4 nucleotidi in uguale concentrazione tra loro.

•

→

La miscela viene inserita in un termo ciclatore , strumento che automaticamente alza e abbassa la temperatura.

FASI :

1. DENATURAZIONE:

a 94-95 °C si separano i filamenti del DNA stampo, tramite la rottura dei legami a idrogeno.

2. ANNEALING ( appaiamento)

vengono aggiunti i primer , la temperatura viene abbassata a 45-60° per permettere la creazione del

legame tra i primer e il DNA stampo. La temperatura di annealing varia a seconda della specificità che si

vuole ottenere (temperatura bassa = generico, temperatura alta = specifico).

3. ALLUNGAMENTO .

Vengono sintetizzati nuovi filamenti complementari grazie all'attività della polimerasi che aggiunge

→

nucleotidi in direzione 5' 3'. Temperatura attorno ai 68- 72°C.

Queste tre fasi si ripetono per 30-40 volte, si sceglie con molta cura la regione di DNA da amplificare lunga circa

20-30 paia di basi ( non meno di 16 perchè è troppo corta e la sequenza può essere presente anche un altri punti del

genoma). Non posso realizzare dei primers molto lunghi perchè sono costosi. Le estremità 3' non devono essere

tra loro complementari, rischio che si formino dei dimeri. Possono essere utilizzati anche dei primer “generici” per

amplificare diversi frammenti di DNA di partenza, per una successiva analisi di corsa elettoforetica. Possono

essere usati primers “specifici” di inizio e fine sequenza ricercata, per un'identificazione più precisa.

La PCR è di fatto una clonazione in vitro, i tempi di realizzazione sono molto brevi, ma l'accuratezza non è sempre

elevata e sono alti i rischi di contaminazione. Questa tecnica può essere utilizzata anche per l'identificazione della

presenza di uno specifico gene, con conseguenti applicazioni di diverso genere.

Posso introdurre anche più tipi di primer nella stessa PCR, così amplifico più frammenti di DNA (PCR multipla) per

poi separarli tramite elettoforesi.

VANTAGGI SVANTAGGI

Sensibilità Sensibilità ( rischio di contaminazione )

Rapidità (1-2 ore) Variabile efficienza di amplificazione a seconda della

sequenza.

Posso analizzare molti campioni, grazie ai Richiede conoscenze di base delle sequenze da

termociclatori avanzati amplificare e realizzazione di specifici primers

Posso analizzare diverse sequenze dello stesso Può sintetizzare frammenti relativamente corti ( 100-

campione 1500 bp)

Posso analizzare diversi tipi di DNA

UTILITA' DELLA PCR :

manipolazione e sequenziamento del DNA

• identificazione reperti biologici

• studi dei polimorfismi del DNA

• identificare ingredienti allergenici in alimenti

• ricerca di OGM (mais BT, soia round up ready)

• ricerca di microrganismi patogeni negli alimenti

•

ELETTROFORESI : tecnica per la separazione dei frammenti di DNA/RNA.

Viene effettuata la migrazione dei frammenti di DNA in una matrice polimerica porosa (gel di agarosio), le molecole

vengono separate in base alla loro dimensione, le molecole più piccole migrano nel gel più velocemente.

Si prepara una miscela di agarosio che viene fatto solidificare una camera elettroforetica, la

• concentrazione di agarosio varia a seconda delle dimensioni delle molecole da separare.

Si inserisce il “pettine” che crea dei pozzetti allineati in cui verranno caricati i campioni.

• Quando il gel si è solidificato si inserisce una soluzione di tampone da corsa, per garantire il passaggio di

• corrente continua.

Si applica un campo elettrico, il DNA migra dal polo negativo a quello positivo, perchè possiede i gruppi

• fosfato che le rendono negativo.

I campioni di DNA vengono posizionati nei pozzetti, e le molecole si separano in base alle dimensioni.

• Viene inserito anche una miscela di DNA marcatore di peso molecolare , ovvero un DNA standard con

• frammenti di dimensioni note che mi aiuterà a capire che dimensioni hanno i frammenti del mio campione.

La visualizzazione diretta delle bande su gel avviene utilizzando intercalanti del DNA, che diventano

• fluorescenti se illuminati con raggi a specifiche lunghezze d'onda ( molto utilizzato è il bromuro di eitdio

che emette fluorescenza di colore rosso-arancio).

UTILITA' :

valutare le caratteristiche (dimensione, peso molecolare) dei singoli frammenti.

➔ Estrarre frammenti con estremità appiccicose per ottenere DNA ricombinante.

➔ Individuare mediante ibridazione con sonde uno specifico frammento di DNA

➔

SEQUENZIAMENTO DEL GENOMA

ideato da Sanger negli anni '70. → →

Digestione del genoma con enzimi di restrizione ottengo i frammenti da sequenziare li separo con

elettroforesi.

Occorre : un primer con sequenze note, DNA polimerasi per l'allungamento dell'innesco, 4 desossi nucleotidi

(dNTP),

dNTP : sono dei nucleotidi privi del gruppo OH in C 3' , non possono legarsi al nucleotide successivo e quindi

bloccano la sintesi del nuovo filamento. Il blocco non è totale, avviene solo in quei filamenti dove si inserisce un

dNTP, se ci sono nucleotidi normali la sintesi procede normalmente.

Ogni dNTP è associato ad un marcatore fluorescente di colore diverso ( 1 colore per ogni base azotata), così la

sequenza nucleotidica viene determinata dall'analisi dei picchi colorati corrispondenti ai diversi nucleotidi che si

legano al filamento stampo, ad opera di un rilevatore e di un software apposito.

1. Denaturazione del frammento di DNA analizzato.

2. Inserisco un primer complementare ad un'estremità del filamento

3. inserisco una DNA polimerasi e una miscela di nucleotidi e dNTP marcati fluorescenti.

4. DNA polimerasi si attacca al primer e comincia a sintetizzare il nuovo filamento utilizzando i nucleotidi a

disposizione.

5. Quando si attacca un dNTP la sintesi del filamento si blocca perchè manca un OH, quindi in fondo al

frammento sintetizzato ho un dNTP fluorescente.

6. Ottengo vari frammenti di dimensioni diverse che terminano con basi marcate fluorescenti, ho quindi una

miscela composta da frammenti che differiscono per la loro dimensione.

7. Metto i miei frammenti neosintetizzati in una corsa elettroforetica ( pori molto fini perchè i frammenti

differiscono