Biochimica metabolica

Lezione del 28/02

Reazione di polimerizzazione

La prima reazione che andiamo a considerare è la reazione che porta alla polimerizzazione, ovvero la reazione che parte da semplici monomeri e porta alla formazione di macromolecole complesse. Questo vale ovviamente per proteine, acidi nucleici o triacilgliceroli ad esempio, che sono la forma mediante la quale depositiamo acidi grassi nel nostro organismo.

S = n^L dove n è uguale al numero di diversi tipi di subunità di una determinata categoria di composti mentre L è la lunghezza della sequenza lineare. Ci dice che il numero di diverse sequenze possibili di lunghezza L sarà uguale a questa equazione; possiamo quindi capire che per una proteina di lunghezza media di 400 Aa circa può avere una variabilità degli Aa che compongono la proteina di 20⁴⁰⁰. Se a questo aggiungiamo gli eventi post-trascrizionali e post-traduzionali possiamo comprendere quanto sia importante la fine regolazione di tutto quello che avviene nel nostro organismo.

Gruppi funzionali

Osserviamo i più importanti gruppi funzionali presenti nei metaboliti o nelle molecole che compongono il nostro organismo:

• Gruppo ossidrilico: spesso associato ad una molecola di tipo alcolico.
• Etere: i ponti eteri di una molecola lineare derivano normalmente dalla condensazione di due gruppi ossidrilici.
• Gruppi carbonilici: la maggior parte delle reazioni si basano sulla presenza di questi gruppi. È rappresentato dal carbonio legato con un doppio legame all'ossigeno, ed è un gruppo estremamente reattivo.
• Gruppo carbossilico: è un gruppo carbonilico che possiede un gruppo ossidrilico. Un parametro importante di questo gruppo è il pKa, che ci dice se il gruppo si trova in forma protonata o deprotonata. Vedremo che molte reazioni nel nostro organismo, in particolare reazioni di detossificazione, servono a cambiare il pKa dei gruppi carbossilici affinché siano deprotonati quindi carichi negativamente e pertanto più solubili in acqua, in quanto la solubilità è molto importante per la detossificazione.
• Estere: dato dalla condensazione tra un acido carbossilico ed un alcol. Anche in questo caso osserviamo un gruppo carbonilico.
• Tioestere: condensazione tra un acido carbossilico ed un tiolo. L'ossigeno è sostituito dallo zolfo. Un esempio di legame tioestere è quello presente nell'acetil-CoA.
• Anidride: condensazione tra due gruppi carbossilici con perdita di un H₂O. Ci sono due gruppi carbonilici con un ponte ad ossigeno. Alcune anidridi provengono dalla condensazione di un acido organico con uno inorganico come ad esempio l'acido ortofosforico per darci un’anidride mista in cui l'ossigeno unisce il carbonio carbonilico ad un gruppo fosfato; l'aggiunta di un gruppo fosfato è molto importante per l'attivazione di una molecola.
• Fosfoanidridi: equivalenti alle anidridi ma sono coinvolti, nel legame del ponte ossigeno, due atomi diversi dal carbonio.
• Ammidico: presente nelle proteine, condensazione tra un gruppo carbossilico ed amminico. Questo legame può anche essere chiamato come legame carboammidico, formato prevalentemente nel processo di sintesi delle proteine a livello dei ribosomi durante il processo di traduzione. Si può anche formare il legame carboammidico in altre situazioni. Questi gruppi possono formarsi anche come risultato di stress ossidativo, e possono portare a delle carbonilazioni delle proteine. È stata trovata infatti una sonda fluorescente marker per questi gruppi carbonilici non fisiologici che ci permettono di capire lo stress ossidativo di queste cellule.

Sostituenti

• Gruppi metilici.
• Gruppi etilici.
• Amminogruppi: che ha caratteristiche basiche, in quanto presenta il doppietto sull'azoto.
• Fosforilico: quando il gruppo si lega normalmente viene legato considerando l'ossigeno che viene donato dal gruppo OH della molecola accettrice del fosforile, quindi non tutti gli ossigeni derivano dall'ortofosfato. La fosforilazione è un processo che incontreremo praticamente sempre.
• Sulfidrilico: presente nell'acetil-CoA o nella cisteina. Molti gruppi sulfidrilici sono sensori dello stato redox cellulare perché le cisteine possono trovarsi in forma ridotta con gruppo SH o in condizioni ossidative sotto forma di cistina formando un ponte disolfuro fondamentale per la stabilizzazione della struttura terziaria delle proteine. Il rapporto tra i gruppi tiolici liberi ed i gruppi disolfurici nelle proteine è indice dello stato redox in generale.
• Gruppo fenilico: gruppo aromatico.

Reazioni biochimiche

Osserviamo le reazioni più importanti che incontreremo:

• Reazioni che formano legami C-C e la loro rottura.
• Isomerizzazione ed eliminazione.
• Reazioni che portano alla formazione di radicali liberi, che presentano un elettrone spaiato quindi sono altamente reattivi.
• Trasferimento di gruppi chimici.
• Reazioni di ossidoriduzione.

Principi chimici

Prima di vedere queste reazioni consideriamo due principi chimici:

Primo principio di base

Un legame covalente C-C è costituito da una coppia di elettroni condivisi e può essere rotto in due particolari modi:

1. Rottura omolitica: il legame, ad esempio considerando il legame C-H, è rotto assegnando un elettrone al C ed uno all'H.
2. Rottura eterolitica: porta alla formazione di un carbocatione e di carboanione.

Secondo principio chimico di base

Molte reazioni biochimiche coinvolgono reazioni tra nucleofilo ed elettrofilo. Quali sono i gruppi nucleofili che incontreremo più spesso?

1. Ossigeni carichi negativamente che dipenderanno dai residui proteolitici cioè i residui con caratteristiche acido-base, come nel caso del gruppo carbossilico.
2. Gruppo sulfidrilico.
3. Carboanione.
4. Gruppo amminico non carico che presenta un doppietto libero sull'azoto che può fare un attacco nucleofilo.
5. Analogamente si può avere un attacco nucleofilo da parte di uno degli azoti dell'anello imidazolico.
6. Ione idrossido.

Tutti questi gruppi sono caratterizzati da una carica negativa o un doppietto elettronico che possono fare un attacco su un centro elettrofilo. Quali gruppi si comportano da elettrofili?

1. Carbonio carbonilico, che presenta parziale carica positiva dovuta al legame con l'ossigeno che risulta molto più elettronegativo.
2. Gruppo immidico protonato: il carbonio ha un doppio legame con l'azoto e porta all'attivazione per un attacco nucleofilo sull'azoto.
3. Fosforo: di un gruppo fosfato o fosforilico (si dice fosforilico invece di fosfato quando il gruppo non è libero ma appartiene ad una molecola). Il fosforo si comporta da elettrofilo poiché gli ossigeni risultano molto più elettronegativi, inoltre il fosforo può formare 5 legami covalenti formando una struttura tetravalente tetraedrica in alcuni casi, quindi può essere un buon gruppo uscente.
4. Protone H⁺.

Reazioni che formano legami C-C o che li rompono

Per formare un legame C-C quello che avviene è che un carbocatione ed un carboanione reagiscano tra loro e formino un legame covalente. Ma per poter fare questo tipo di reazione, carbocationi e carboanioni sono instabili e quindi il costo energetico per poter avere degli intermedi di reazioni di questo tipo, almeno che non siano stabilizzati da enzimi, anche se a livello enzimatico il costo energetico sarebbe eccessivo, fa sì che si debba trovare una modalità per stabilizzare gli intermedi carbocationici o carboanionici. Molte di queste reazioni saranno utilizzate per immettere nelle nostre molecole un gruppo carbonilico in quanto il gruppo carbonilico fa in modo che ci possa essere un centro che stabilizzi la forma anionica di un carbonio adiacente.

Perché il carbonile stabilizza un carboanione? Perché può formare un ibrido di risonanza in quanto il doppietto del carboanione può ribaltarsi sull'ossigeno formando un ossigeno anionico e questo ibrido abbassa l'energia libera del prodotto. Analogamente i gruppi immidici possono favorire e stabilizzare un carboanione. Il carboanione ribalta il doppietto formando il doppio legame carbonio carbonio, annulla la carica positiva su gruppo imminico formando questa specie caratterizzata da una forma ibrida di risonanza tra le due possibili organizzazioni di doppi legame.

Un altro metodo per favorire questo ausilio da parte del gruppo carbonilico dei carboanioni intermedi è rappresentato dalla presenza o di metalli o con gruppi acidi che in virtù della formazione di un'interazione a H con l'ossigeno carbonilico possono stabilizzare ancora di più le forme intermedie carboanioniche.

Osserviamo ora degli esempi di formazione e rottura di legami covalenti:

• La condensazione aldolica che incontriamo nella reazione catalizzata da aldolasi durante la glicolisi. Perché si chiama aldolasi? Nonostante provochi la rottura di un legame, il nome dipende dal fatto che molto spesso gli enzimi che possono catalizzare la reazione nel senso diretto ed inverso prendono il nome della prima reazione che è stata scoperta per quell'enzima ed in questo caso la condensazione aldolica. La aldolasi è un enzima necessario per rompere una molecola di uno zucchero a 6 atomi di carbonio in due triosi, anche in questo caso si forma un carboanione che attacca in maniera nucleofila il carbonio carbonilico di una molecola chetonica.
• Un altro esempio è la condensazione di Claisen che è una condensazione alcolica ma che coinvolge come gruppo carbonilico un gruppo presente in un estere, come ad esempio nella formazione dell'acido citrico, o tiolasi nella formazione dei corpi chetonici, o decarbossilazione di un Beta-chetoacido partendo da un acetato.

I carbocationi possono essere coinvolti anche nella reazione che appartiene alla formazione di un intermedio della biosintesi del colesterolo che parte da un intermedio semplice che è l'Acetil-CoA: l'isopentenilpirofosfato si unisce al dimetilallipirofosfato. Il dimetilallipirofosfato presenta un gruppo pirofosfato che è un buon gruppo uscente per caratteristiche energetiche; quando questo gruppo fuoriesce lascia un carbocatione dimetillallilico che può essere attaccato efficacemente dal doppio legame dell'isopentenilpirofosfato formando il geranil-pirofosfato.

Utilizzo dell'idrolisi di ATP

A cosa serve precisamente l'idrolisi di ATP? Molto spesso si pensa che l'idrolisi che è una reazione altamente esoergonica sia l'energia che sfruttiamo per far funzionare una reazione endoergonica. Se idrolizzo ATP però io libero calore che non è prettamente utilizzabile come fonte di energia; dobbiamo trovare un modo per intrappolare questa energia di idrolisi sulla molecola che deve reagire nella reazione endoergonica.

Enzimi nella formazione e rottura di legami covalenti C-C

Rivediamo alcuni enzimi che servono alla formazione o rottura di legami covalenti C-C:

1. Ligasi: sono reazioni catalizzate da enzimi in cui due atomi vengono uniti utilizzando l'energia di ATP o altre fonti energetiche; a questo gruppo appartengono le sintetasi.
2. Sintasi: catalizza una condensazione con formazione di un legame covalente senza aver bisogno di nucleotidi trifosfato come fonte di energia (ATP, GTP, UTP CTP).
3. Liasi: catalizzano le reazioni di rottura o reazioni in cui si hanno riarrangiamenti elettronici.

Riarrangiamenti interni: isomerizzazioni ed eliminazioni

La molecola si riarrangia, senza necessariamente far variare lo stato di ossidazione globale della molecola stessa. Con stato di ossidazione globale non si intende lo stato di ossidazione dei carboni che appartengono alla molecola, poiché posso avere una reazione di isomerizzazione in cui una molecola si trasforma nel suo isomero. Anche nel caso delle reazioni di eliminazione in cui si ha l'eliminazione di gruppi funzionali, non si ha la variazione dello stato di ossidazione globale però riarrangia la molecola, ad esempio tramite la formazione di un doppio legame e con eliminazione di una molecola di H₂O.

Isomerizzazione: un esempio è l'isomerizzazione del glucosio 6 P a fruttosio 6P ed è un’isomerizzazione accoppiata, associata ad una ossidoriduzione poiché il glucosio che è un aldoso viene isomerizzato a fruttosio e questo non cambia lo stato di ossidazione globale ma cambia il numero di ossidazione del carbonio, in quanto il carbonio in posizione 2 del fruttosio è più ossidato rispetto al carbonio alcolico del glucosio.

Per poter fare questa isomerizzazione a livello del sito catalitico che lega il glucosio 6P ci sono diverse tappe di reazione con formazione di intermedi: in questo caso si forma un intermedio enediolo ovvero un intermedio in cui ci sono due carboni con gruppi ossidrilici legati da un doppio legame. Quello che accade è che B1 e B2 che appartengono alla struttura dell'enzima sono rappresentati dai gruppi ionizzabili o proteolitici che possono accettare o cedere un protone quindi spesso con caratteristiche acido-base: B1 estrae un protone e questo fa sì che il doppietto disponibile possa formare un doppio legame C-C ed il doppio legame C-O si ribalta sull'ossigeno formando un ossigeno anionico; quest'ultimo strappa il protone al gruppo B2, B1 estrae un protone e B2 lo cede; si forma questo intermedio in cui abbiamo due gruppi OH sui carboni adiacenti legati da doppio legame. Il doppio legame può fungere da nucleofilo, attaccando e strappando il protone dal gruppo B1, il doppietto elettronico forma il legame C-H con il protone donato da B1 che ritorna al suo stato di partenza, B2 riestrae il protone dal secondo gruppo ossidrilico formando un doppio legame C-O. Lo scambio di protoni fa sì che avvenga una semplice reazione di isomerizzazione.

Reazioni che coinvolgono radicali liberi

Ad esempio la reazione di trasferimento di un gruppo intramolecolare caratterizzata da vitamina B12 (cobalamina). In particolare ci soffermeremo su questa vitamina in quanto una carenza di essa, così come la carenza di folato, è associata ad anemia perniciosa. Perché la reazione è radicalica? Il cobalto si trova in uno stato di ossidazione Co³⁺, ed esso può strappare un atomo di H alla deossiadenosina formando il radicale deossiadenosinico e trasformandosi in Co²⁺. La deossiadenosina come radicale va ad attaccare un substrato formando il radicale del substrato, il radicale può riarrangiarsi all'interno della molecola e quindi spostare il gruppo mediante riarrangiamento radicalico sull'altro carbonio ed in questo modo all'interno della stessa molecola abbiamo un gruppo reattivo che è formato da un elettrone spaiato. Ci sono reazioni di tipo radicalico che possono, se non vengono trovati a livello enzimatico, portare alla formazione di radicali liberi. Fin quando i radicali fanno parte dell'intermedio di reazione legato covalentemente all'enzima o ai residui dell'enzima stesso non sono nocivi mentre se il radicale viaggia potrebbero provocare problemi: ad esempio il sistema di detossificazione della citocromo P450 che serve a detossificare le sostanze tossiche ad un certo punto forma una specie altamente reattiva di tipo radicalico.

Abbiamo delle molecole radicaliche nel nostro organismo? Sì, un esempio è l'ossigeno che in particolare è una molecola endogenamente radicalica in quanto presenta due elettroni spaiati negli orbitali esterni; i due elettroni hanno spin parallelo e non possono attaccare due elettroni di un legame covalente che hanno spin opposto. Potrebbero attaccare due elettroni che abbiano spin parallelo tra loro, grazie a questa disposizione di spin non ossida tutta la materia organica del nostro pianeta.

Trasferimento di gruppi chimici

Uno dei transferimenti che ricopre particolare importanza è il trasferimento del gruppo fosforilico che è molto importante poiché è un ottimo gruppo uscente, quindi spesso l'attacco di un gruppo fosforilico ad un metabolita serve ad attivarlo dando a questo metabolita un'energia libera in più affinché possa procedere nella reazione successiva. Il trasferimento di gruppi fosforilici è molto importante in quanto l'ortofosfato (gruppo fosfato) quindi il fosfato inorganico Pi, così come il pirofosfato, PPi, sono tra i migliori gruppi uscenti nelle sostituzioni nucleofile.

Perché è un buon gruppo uscente? È un gruppo molto stabile quindi quando esce il fosfato da una molecola che lo possiede come gruppo fosforilico in soluzione può essere scritto in questo modo: avrà un legame doppio con ossigeno e 3 legami con altri 3 ossigeni. In realtà però la molecola dovrebbe essere scritta più correttamente in questo modo: con una parziale delocalizzazione del doppio legame su tutti e 4 gli atomi di ossigeno. Questo conferisce stabilità al fosfato e pertanto è un buon gruppo uscente.

Come è trasferito il gruppo fosfato? Prendendolo dall'ATP, dove l'ossigeno del carbonio 6 del glucosio fa un attacco nucleofilo sul fosfato che ha una carica positiva, lo stacca da ATP producendo ADP e Pi e producendo glucosio 6P che rappresenta la forma attiva del glucosio. Una volta che il glucosio entra nella cellula viene subito fosforilato, e non solo perché in questo modo viene attivato ma anche perché in questo modo non può più fuoriuscire dalla cellula poiché il trasportatore del glucosio non può trasferire glucosio fosforilato.

Chinasi: enzimi che trasferiscono il gruppo fosforilico da un nucleoside trifosfato come l'ATP ad un accettore che può essere una proteina come glicogeno fosforilasi o sintasi chinasi che hanno come substrato accettore un gruppo OH di un residuo di serina, treonina e tirosina, uno zucchero come esochinasi o glucochinasi. Può avere anche un altro nucleoside come la nucleoside difosfato chinasi che trasferisce un gruppo fosfato da un nucleoside ed un altro oppure un intermedio metabolico come la PEPCK che è un importante enzima coinvolto nel metabolismo del glucosio.